双印迹：解决第二抗体非特异性结合问题

在免疫印迹技术中印迹蛋白与非相关第二抗体之间的相互作用会产生假阳性。已经开发了某些程序以期减少这种吸附。Gershoni在1988年就已强调解决这一问题的困难。通过使用一种新膜(DB膜)，并从印迹蛋白中提取原始抗体，使这种程序消除了干扰蛋白，并使第二抗体的非特异性结合成为不可能，因此认为上述非特异性结合问题能够解决。

肝癌细胞特异性结合抗体的筛选及序列测定

目的 通过噬菌体展示技术筛选与肝癌细胞特异性结合的抗体。方法 用肝癌细胞系SMMC772 1免疫小鼠 ,提取脾细胞总RNA ,构建单链抗体库 ,从中筛选特异性结合的抗体。结果 构建了一个库容量为 2× 10 5的单链抗体库 ,并筛选到 1个与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体 单链抗体。此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低 12 5倍以上。结论 本研究成功构建了单链抗体库并筛选到与靶细胞特异性结合的噬菌体 单链抗体。

家蚕微孢子虫Nosemabombycis抗体蛋白非特异性结合的去除研究

Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ（Ｎ．ｂ）抗血清常受非特异性干扰而难于实用。本试验通过硫酸铵盐析、透析袋及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—２５柱层析脱盐、ＤＥＡＥ纤维素柱层析、组织粉吸收等一系列纯化过程，并经ＰＡＣＥ电泳检查表明所获得的高纯度抗体蛋白成分具有很强的特异性。用以制成致敏炭素检液，对Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ发生阳性反应，对ＳＣＭ６、ＳＣＭ７均不发生阳性凝集反应。经万余张原种实用性试验，证明其灵敏度增强５０倍，误判率为０，可以准确无误地检出Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ，具有广泛的应用前景。

EGFR特异性单链抗体与靶细胞结合的特异性

目的:检测EGFR特异性单链抗体F4-scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合特性。方法:提取细菌周质腔蛋白经N i-NTA柱纯化F4-scFv;采用流式细胞术及W estern b lot检测F4-scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合的特异性。结果:N i2+柱纯化的F4-scFv经SDS-PAGE可见分子量为36 kDa单一条带,F4-scFv可与EGFR阳性细胞CHO-EGFR-GFP1、A431及MDA-MB-231特异性结合,而不与EGFR阴性细胞CHO-K1及SKOV3结合。结论:F4-scFv可与天然表达EGFR的细胞特异性结合,为其靶向抗肿瘤研究奠定了基础。

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。

肾综合征出血热特异性抗体的检测与中西医结合治疗的研究

目的 :探索一种更为简便、快速、特异、灵敏的肾综合征出血热 (hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS)抗体的检测方法及更为有效的中西医结合治疗手段。方法 :5 5 9例HFRS患者血清同时采用免疫滴金法 (colloidalgoldimmuno dotas say,CGIDA)与酶联免疫吸附法 (enzymelinkedimmunosorbentassay ,ELISA)对比检测特异性免疫球蛋白M抗体 (抗HFRS IgM) ,间接免疫荧光法 (indirectfluorescentantibodytest ,IFAT)对比检测特异性免疫球蛋白G抗体 (抗HFRS IgG)。 10 1例HFRS患者分组进行中西医结合治疗 ,治疗组 5 0例用苦黄注射液、参麦注射液联合黄芪口服液 ,对照组 5 1例用利巴韦林注射液联合甘利欣注射液 ,针对老年患者的临床特点 ,及早采用综合性防治措施。结果 :5 5 9例HFRS患者血清 ,以CGIDA法检测抗HFRS IgM ,阳性 396例 (70 .8% ) ;以CGIDA法检测抗HFRS IgG ,阳性 4 89例 (87.5 % )。治疗组与对照组用药后退热天数、主要症状和体征缓解天数相似 (P >0 .0 5 ) ;肾功能恢复天数 ,对照组优于治疗组 (P <0 .0 1) ;在越期方面 ,治疗组越休克期数明显高于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :CGIDA法检测HFRS特异性抗体分别与ELISA法及IFAT法对照 ,均有简便、快速、特异、灵敏之优点 ,检测抗HFRS IgM 。

原发免疫性血小板减少症患者特异性自身抗体种类对中医药结合地塞米松治疗疗效的影响

目的:观察原发免疫性血小板减少症患者特异性自身抗体种类对中医药结合地塞米松治疗疗效的影响。方法:选取93例原发免疫性血小板减少症患者作为研究对象,均采取补脾益肾方结合地塞米松治疗方案。记录不同特异性自身抗体种类患者的治疗有效率及不良反应发生情况。结果:93例患者中,总有效率为69.9%。其中Ig G组中单一抗GPⅡb/Ⅲa阳性、单一抗GPⅠbα阳性、抗GPⅡb/Ⅲa+GPⅠbα双阳性及抗GPⅡb/Ⅲa+GPⅠbα双阴性的有效率分别为87.5%、41.2%、61.5%、72.3%,组内比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Ig M组单一抗GPⅡb/Ⅲa阳性、单一抗GPⅠbα阳性、抗GPⅡb/Ⅲa+GPⅠbα双阳性及抗GPⅡb/Ⅲa+GPⅠbα双阴性的有效率分别为85.7%、85.7%、63.6%、67.2%,组内比较,差异无统计学意义(P>0.05)。93例患者不良反应发生率为8.6%,安全性较高。结论:原发免疫性血小板减少症患者特异性自身抗体种类对中医药结合地塞米松治疗的疗效有一定影响,主要体现在Ig G抗体,以抗GPⅠbα-IgG抗体疗效较差。

免疫滴金技术检测肾综合征出血热特异性抗体与中西医结合治疗的研究

为探索一种更为简便、快速、特异、敏感的肾综合征出血热(HFRS)抗体的检测方法及中西医结合治疗该病的有效手段。186例HFRS病人血清同时采用免疫滴金法(CGIDA)与酶联免疫吸附法(ELISA)对比检测特异性免疫球蛋白M抗体(抗HFRS-IgM)、免疫荧光法(IFAT)对比检测特异性免疫球蛋白G抗体(抗HFRS-IgG),并以20例发热待排、48例病毒性肝炎血清作对照;101例HFRS病人分组进行中西医结合治疗,治疗组用苦黄、参麦注射液联合黄芪汤,对照组用利巴韦林联合甘利欣注射液。186例HFRS病人血清,以CGIDA检测者5～10分钟出结果,抗HFRS-IgM阳性132例(70.9％),抗HFRS-IgG阳性163例(87.1％);ELISA法检测抗HFRS-IgM4小时出结果,阳性167例(89.7％),IFAT法检测抗HFRS-IgG阳性135例(72.5％)。对照组均呈阴性结果。治疗组50例与对照组51例用药后退热天数、主要症状、体征缓解天数相似(P>0.05),尿蛋白消失天数及肾功能恢复天数,对照组优于治疗组(P<0.05),在越期方面,越休克期治疗组优于对照组(P<0.05),越少尿期及从发热期直接进入多尿期,两组情况相似(P>0.05)。CGIDA检测HFRS特异性抗体分别与ELISA及IFAT对照,均具有快速、简便之优点。检测抗HFRS-IgM,CGIDA敏感性稍差于ELISA,但特异性高于后者;检测抗HFRS-IgG,CGIDA的敏感性及特异性均高于IFAT。。苦黄、参麦注射液联合黄芪汤治疗HFRS与利巴韦林联合甘利欣注射液相比较,疗效无明显差别,但前者优于改善休克情况,后者强于改善肾功能。

免疫滴金技术检测肾综合征出血热特异性抗体与中西医结合治疗的研究

目的：为探索一种更为简便、快速、特异、灵敏的肾综合征出血热(HFRS)抗体的检测方法及更为有效的中西医结合治疗方法。方法：426例HFRS病人血清同时采用免疫滴金法(CGIDA)与酶联免疫吸附法(ELISA)对比检测特异性免疫球蛋白M抗体(抗HFRS-IgM)、免疫荧光法(IFAT)对比检测特异性免疫球蛋G抗体(抗HFRS-IgG)并以20例发热待查、48例病毒性肝炎血清作对照。10l例HFRS病人分组进行中西医结合治疗，治疗组用苦黄、参麦注射液联合黄芪汤，对照组用利巴韦林联合甘利欣注射液。结果：426例HFRS病人血清，以CGIDA法检测抗HFRS-IgM，阳性328例，与ELISA法作结果评价时，CGIDA灵敏度78．9％，特异度100％；以CGIDA法检测抗HFRS-IgG，阳性387例，与IFAT法作结果评价时，CGIDA灵敏度90．8％，特异度100％。治疗组50例与对照组5l例用药后退热天数、主要症状缓解天数相似(P>0．05)，尿蛋白消失及。肾功能恢复天数，对照组优于治疗组(P<0．05)，在越期方面，越休克期及从发热期直接进入多尿期，两组情况相似(P>0．05)。结论：CGIDA法检测HFRS特异性抗体分别与ELISA法及IFAT法对照，均有简便、快速、特异、灵敏之优点，检测抗HFRS-IgM，CGIDA法敏感性差于ELISA法，但是无假阳性；检测抗：HFRS-IgG，CGIDA法的灵敏度高于IFAT法。苦黄、参麦注射液联合黄芪汤HFRS与利巴韦林联合甘利欣注射液相比较，疗效无明显差别，但前者优于改善休克情况，后者强于改善肾功能。

特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:实现特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中高效表达、纯化并鉴定其生物学活性.方法:构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,转化感受态大肠杆菌DH5α,选择测序正确的阳性克隆进行扩增后,电转化酵母细胞,表达抗体二聚体,对表达抗体进行纯化、浓度检测,并鉴定其对肝癌细胞的结合活性,免疫组织化学检测二聚体对肝癌组织抗原的特异性.结果:测序显示成功构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,表达96h抗体收获量最大,二聚体表达量为30mg/L菌液,为大肠杆菌的300倍.抗肝癌单链抗体二聚体BDM与三种肝癌细胞结合,而与正常肝细胞不结合,结合效价为1:128.免疫组织化学显示二聚体与肝癌组织结合的阳性率比肝硬化、胃癌、正常肝组织高,差异有统计学意义.结论:成功制备了高表达量、高特异性、较好的活性及稳定性的抗肝癌单链抗体二聚体BDM,为制备免疫纳米颗粒及开展肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础.

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体的生物学活性研究

背景与目的目前,常规疗法已难以提高卵巢癌患者的生存率,已有实验数据及临床前试验结果表明,双特异性抗体能有效介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究旨在通过检测抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-I)的生物学活性,为其临床前试验及应用提供实验依据。方法观察BHL-I介导的外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)与靶细胞SKOV3结合、MTT法检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)增殖及PBL对靶细胞SKOV3杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBL分泌hIFN-γ、hTNF-α变化。结果BHL-I介导的花环形成率(15.7%)显著高于对照组(11.1%)(P<0.01);在抗原存在下,BHL-I显著促进PBMC增殖和PBL对靶细胞的杀伤(P<0.01),且杀伤率与花环形成率呈正相关(r=0.946);杀伤过程中上清液中hIFN-γ、hTNF-α显著增高(P<0.01)。结论BHL-I能介导PBL和SKOV3结合并活化PBL特异杀伤效应,杀伤可能与其hIFN-γ、hTNF-α表达增高有关。

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。

抗人膀胱癌双特异性抗体的免疫荧光素标记及生物学活性检测

目的通过直接荧光素标记法和免疫组织化学方法对抗人膀胱癌双特异性抗体(BsAb)的免疫学活性进行检测。方法应用异硫氰酸荧光素(FITC)通过免疫荧光染色技术对抗人膀胱癌双特异性抗体进行免疫荧光标记。应用标记好的免疫荧光双特异性抗体对人膀胱癌组织的石蜡切片进行直接染色,并同时以正常膀胱粘膜标记作为对照组,通过荧光显微镜观察标记显色情况。结果免疫荧光标记后的抗体,通过凝胶过滤法收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定FP比值约为082。标记后抗体对膀胱癌组织及对照组正常组织分别进行标记显色,膀胱癌组织呈黄绿色荧光,而对照组正常组织无任何荧光显色,其中膀胱癌组织切片标记显色率约为90%,正常膀胱组织切片显色率为0,两者相比较,差异极具显著性意义(P<001)。结论抗人膀胱癌双特异性抗体对膀胱癌组织有特异性结合能力,证实了我科所制备的抗人膀胱癌双特异性抗体具有较高的免疫生物学活性。

双特异性单克隆抗体在治疗中的应用

双特异性抗体由于其独特的结构——两个不同抗原,引起研究机构广泛的重视。双特异性单克隆抗体有两个臂,研究者将治疗药物和针对疾病部位的特异目标分别放在两个臂上。治疗药物可以是药品、毒素、酶、DNA和放射性核素等。此外,双特异性单克隆抗体能使免疫效应细胞的细胞毒性作用于致病细胞或者诱导产生全身免疫应答。双特异性单克隆抗体从治疗来看,有很大的发展前景,这是由于:(1)最近重组DNA技术的重大突破;(2)人类基因组图谱工程的完成,提高了疾病的鉴别水平;(3)对人类免疫系统机制有了更好的了解。

单链抗体骨架1区在与抗原结合中的作用

[目的 ]探讨单链抗体可变区骨架 1区对抗体特异性的影响 .[方法 ]应用分子克隆技术 ,以分离自重症肌无力患者胸腺的抗原结合片段Fab 6 37为亲本 ,构建了完整序列的单链抗体ScFv 6 37以及在重链和轻链可变区骨架 1区N端各缺失 8个氨基酸的单链抗体ScFv6 37Δ8aa ,在大肠杆菌表达后 ,应用放射免疫测定法检查单链抗体与抗原 人乙酰胆碱受体的结合活性 .[结果 ]单链抗体ScFv 6 37Δ8aa不能与人乙酰胆碱受体结合 ,然而在同一试验中 ,单链抗体ScFv 6 37能高亲合性地与人乙酰胆碱受体结合 .[结论 ]单链抗体骨架 1区的结构可影响抗体与抗原表位的结合特异性 .

抗α干扰素双特异性抗体的制备与初步评价

目的:研制对α干扰素(IFN-α)中和活性有突破性提升的双特异性抗体。方法:以靶向IFN-α不同表位的中和单抗Amilimumab和Sifalimumab为基础,采用FIT-Ig(Fabs-in-tandem immunoglobulin)双特异性抗体平台技术,通过分子克隆方法构建针对IFN-α的双特异性抗体FIT2的表达载体,并在Free Style 293-F系统中进行瞬时转染表达;采用protein A柱亲和纯化目标双特异性抗体,SDS-PAGE初步考察目标抗体的相对分子质量、组分及纯度;采用forte BIO系统鉴定其整体结合活性,并分别确认双特异性抗体的2个抗原结合表位的活性;通过ELISA方法评价其特异性,37℃放置实验鉴定其稳定性,Daudi细胞增殖实验定量评价双特异性抗体的中和活性。结果:构建了双特异性抗体FIT2表达载体,在Free Style 293-F系统中实现了瞬转高效表达,表达量为127 mg/L,亲和纯化获得目标双特异性抗体FIT2,纯度可达98.5%;FIT2结构稳定,具有良好的特异性,未发现与其他类型的干扰素及细胞因子存在交叉反应;FIT2对IFN-α1b-His的结合活性显著优于2个亲本抗体,特别是解离过程的改善尤为明显;同时,FIT2有效保留了2个抗原结合表位的活性;细胞增殖实验结果显示,FIT2对IFN-α1b具有优越的中和活性,其中和效能显著高于任一亲本抗体,明显优于2个亲本抗体联用。结论:获得了对IFN-α1b中和活性有突破性提升的双特异性抗体FIT2,特异性良好且结构稳定,有望成为治疗IFN-α相关疾病的良好的成药候选分子。

乙肝患者抗HBs独特型抗体特异性免疫复合物的检测与意义

临床与实验研究均已证明,乙肝患者循环中有抗HBs（Abl）的独特型抗体（Ab2）存在。这些抗HBs-Ab2是否会与抗HBs形成特异性免疫复合物（抗HBs-Ab2-ICs）?这种ICs有何临床意义?我们参考有关文献建立了一种ELISA法对此进行了研究。此法原理:

取自麻风患者的抗酚糖脂—1的人单克隆抗体及特异性抗基因型的制取

用GM4672淋巴母细胞株与麻风患者外周血单核细胞融合的杂交瘤产生人单克隆抗体（MAb）,用ELISA对杂交瘤的上清液作免疫球蛋白分类及与麻风菌、酚糖脂—1（PG—1）、单链DNA结合反应,选择了两株细胞的抗体PR4和TH3,进行了特性的研究。此两株抗体都是Igm型Kappa轻链。PR4和TH3都能结合麻风菌、PG—1和单链DNA;PR4还能结合鸟分枝菌和堪萨斯菌;TH3结合堪萨斯菌。酶联免疫抑制试验（酶抑）证实这两种抗体并非结合PG—1终端的双糖分子,