第2代测序技术在甲基丙二酸尿症以及苯丙酮尿症诊断中的应用

目的探讨第2代测序技术在儿童常见遗传代谢病诊断中的价值,提出遗传代谢病诊断的新策略。方法采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对临床诊断的3例甲基丙二酸尿症、2例苯丙酮尿症患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者突变进行验证。结果 3例甲基丙二酸尿症患儿检测发现均为MMACHC基因突变,其中1例为c.80A>G(P.Q27R)和c.609 G>A(P.W203X)复合杂合突变,1例为c.394C>T(P.R132X)和c.567dup T(P.I190fs)复合杂合突变,另1例为c.80A>G(P.Q27R)和c.271dup A(P.R91fs)复合杂合突变。2例苯丙酮尿症患儿检测发现PAH基因突变,其中1例为c.158G>A(P.R53H)和c.838G>A(P.E280K)复合杂合突变,另1例为c.158G>A(P.R53H)和c.1238 G>C(P.R413P)复合杂合突变,上述突变均为已知致病突变位点杂合突变;Sanger测序结果与第2代测序结果相符合。结论本研究提示第2代测序技术具有低成本、高通量、高敏感度以及可灵活设计的特点,可作为儿科临床常见遗传代谢病基因诊断的首选工具。

目标基因捕获结合第2代测序技术检测原发性高血压致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第2代测序技术,对原发性高血压（EH）患者的13个已知致病基因进行突变筛查,探讨EH与致病基因突变的关系。方法提取5例EH患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计内皮素转化酶1（ECE1）、G蛋白调节信号5（RGS5）、钠钾三磷腺苷酶通道β1多肽（ATP1β1）、选择素E（SELE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素受体1（AGTR1）、α-内收蛋白（ADD1）、细胞色素P450 3A亚家族多肽5（CYP3A5）、一氧化氮合酶3（NOS3）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β3（GNβ3）、一氧化氮合酶2A（NOS2A）、苯基乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）和前列腺素I2合成酶（PTGIS）基因外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq 2000第2代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,对选定的突变位点用Sanger测序法验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为301.12~431.92,99.30%~99.70%目标区域覆盖度。5例患者中ADD1基因发现3个错义突变;AGT基因发现1个错义突变;SELE基因发现2个错义突变;PNMT基因发现1个剪切位点突变;PTGIS基因发现1个错义突变。结论 GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq 2000第2代测序技术成功发现了EH患者的致病基因突变。该方法快速有效,对深入研究EH的分子病因学有重要意义。

第二代测序技术及其在急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征中的运用

第2代测序技术(next-generation sequencing,NGS)悄然取代经典的Sanger测序技术,成为科研人员发掘人类肿瘤疾病遗传学秘密的最实用、最可靠的方法。随着技术的不断更新及完善,进行全基因组测序不再遥不可及。近年来,部分科学家将此项技术运用于血液系统恶性肿瘤的研究,积极推动急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征的全基因组测序的进程,期待从源头上找出部分血液系统恶性肿瘤的致病机理。本文就第2代测序技术及全基因组测序、外显子基因组测序和转录基因组测序在急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征两种疾病中的运用进行综述。

雌雄鸡胚性腺microRNA表达检测及靶基因预测分析

动物胚胎发育时期伴随着复杂的基因表达和调控过程,特别是microRNA的基因转录后调控。实验应用二代测序技术测定了发育至6.5d雌雄鸡胚性腺中miRNA表达情况,并对差异表达miRNA进行了靶基因分析。检测分析结果显示,在雄性样品中发现375种miRNA,雌性样品中发现372种miRNA。针对30种在两性性腺中显著差异表达的miRNA,实验采用3个软件(Targetscan 6.0,MirTarget2与miRanda)进行靶基因预测分析,共预测出12 477个靶基因,这些基因显著富集在205个GO分类和11条信号通路中。实验为鸟类性别分化调控机制研究和miRNA靶基因分析提供了基本实验数据和方法学参考。

宫颈癌石蜡标本中人乳头状瘤病毒检测方法的初步探讨

目的:探讨适合检测宫颈癌石蜡包埋标本中高危型HPV的方法。方法:用高危型HPV-DNA HC2检测及PCR扩增联合DNA测序法,对25例宫颈癌(宫颈鳞癌23例,宫颈腺癌2例)进行高危型HPV检测。每例取石蜡包埋组织块中的癌组织,21例术前曾于门诊取材(新鲜脱落细胞)行高危型HPV-DNA HC2检洲。结果:(1)21例宫颈癌石蜡标本, PCR扩增法高危型HPV阳性检出率为66．7%;HC2高危型检测阳性检出率为47．6%;(2) PCR扩增法灵敏度为66．7%,特异度为33．3%,与参照标准的符合率为61．9%,阳性预测值为85．7%,阴性预测值为14．3%;(3)HC2检测法灵敏度为44．4%,特异度为33．3%,与参照标准的符合率为42．9%,阳性预测值为80．0%,阴性预测值为9．1%;(4)石蜡标本保存时间与HPV检出率有关。半年以内标本HPV检出率为92．3%(12/13),半年以上者为33．3% (4/12),两者差异有统计学意义(P=0．004)。结论:HPV-DNA扩增(PCR)联合测序法是目前回顾性研究宫颈癌石蜡包埋标本中HPV感染的可行方法;石蜡标本保存时间与HPV检出率有关,石蜡包埋时间越短、标本越新鲜,检出率越高。

第二代测序技术在假肥大型肌营养不良基因诊断中的应用

目的对假肥大型肌营养不良患者进行基因检测。方法采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对6例假肥大型肌营养不良患者进行检测；采用第1代测序技术、多重连接依赖的探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）对患者及其母亲的基因型进行验证。结果1例为第10和11外显子缺失，1例为第16和17外显子重复，4例为点突变。共发现10种变异：C．2776C〉T、c．5475delA、C．6391—6392delCA、IVS64＋1G〉A、12．2645A〉G、C．5244G〉A、C．7728T〉C、C．8729A〉T、C．8734A〉G和C．8810G〉A，前4种为可疑致病性变异，后6种为人群中的多态。其中3例为首次发现的新突变（IVS64＋1G〉A、C．6391—6392delCA（P．Q2131NfsX3）和P．Q926X（CAG〉TAG）。结论通过第2代测序技术可以在一个反应中准确检测出DMD基因的缺失、重复和点突变，具有一定的临床应用价值。

中国北方汉族人群HLA-DQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性分析

目的 调查中国北方汉族人群HLA-DQA1、-DQB1、 HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性。方法 选取2016年中华骨髓库造血干细胞志愿者1 004人的外周血样,采用第2代测序方法(next generation sequence,NGS)进行HLA-DQA1、-DQB1、HLA-DPA1、-DPB1等位基因分型。结果 1 004人份样本中,共检出24种HLA-DQA1、20种HLADQB1、12种HLA-DPA1、40种HLA-DPB1等位基因。各位点频率较高的前3种等位基因依次为HLA-DQA1^(*)01:02:01(15.2%),HLA-DQA1^(*)03:02:01(15.2%),HLA-DQA1^(*)05:05:01(8.0%);HLA-DQB1^(*)03:01:01 (19.0%),HLA-DQB1^(*)03:03:02(16.2%),HLA-DQB1^(*)05:02:01(11.2%);HLA-DPA1^(*)02:02:02(52.2%),HLA-DPA1^(*)01:03:01(33.0%),HLA-DPA1^(*)02:01:01(10.3%);HLA-DPB1^(*)05:01:01(37.0%),HLA-DPB1^(*)02:01:02(17.6%),HLA-DPB1^(*)04:01:01(10.0%)。HLA-DQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1之间的单体型存在连锁不平衡。结论 获得北方汉族人群HLADQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性数据和单体型数据,可为器官移植、群体遗传学和疾病关联研究等提供重要参考数据。

四代DNA测序技术简述

DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术,极大推动了生物学的发展。从20世纪70年代至今,DNA测序技术已历经4代。简介被称为DNA测序始祖的第1代测序技术、边合成边测序的第2代测序技术、不依赖于PCR扩增的第3代测序技术,以及处于研发中的第4代测序技术。

RNA-Seq在果树学研究中的应用

RNA-Seq为植物功能基因组学研究的重要手段,近年来在果树上也有不少成功应用。应用这一技术,可获得高通量的转录本序列信息及表达量数据。本文首先简要介绍RNA-Seq研究背景及其在果实发育与品质形成、芽发育及其调控、果树胁迫响应等方面的应用概况,然后着重分物种追踪了柑橘、葡萄、香蕉、草莓、苹果、梨、桃、樱桃、杨梅、蓝莓这10个常见果树的30余个RNA-Seq实例,介绍了具体应用进展。最后就存在的测序成本和数据处理技术等问题以及测序平台和文库制备等方面的发展趋势进行了讨论。

假肥大型肌营养不良一个核心家系DMD基因分析

目的对临床诊断的假肥大型肌营养不良1例患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查。方法采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对假肥大型肌营养不良患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者及其父母的基因型进行验证。结果发现患儿DMD基因第45外显子存在1个纯合无义突变c.6589A>T(P.Lys2197X),患儿母亲为杂合突变携带者。结论本研究发现了一个尚未报道的致病性基因突变位点,同时发现第2代测序技术可以快速准确检测出DMD基因的点突变,具有一定的临床应用价值,为遗传咨询提供准确信息。

DNA测序技术比较

自从1953年,J.D.Watson和F.H.C.Crick发现DNA的双螺旋模型之后,DNA测序技术随着科学的进步得到了迅猛发展。1977年Sanger[1]发明DNA双脱氧末端终止测序技术,Maxam与Gilbert[2]发明利用化学降解法进行测序的技术,2种测序技术被誉为DNA测序技术的始祖。随后,在第1代DNA测序技术的基础上,相继出现了第2代测序技术、基因芯片技术以及第3代测序技术。总结并展望了每一代测序技术及基因芯片技术的诞生、原理及应用前景,为利用测序技术研究基因表达提供理论基础和实验依据。

1例重症嗜肺军团菌肺炎患者的抗感染治疗分析

目的:探究重症嗜肺军团菌肺炎患者的抗感染治疗方案。方法:临床药师参与1例经第2代测序技术(next-generation sequencing,NGS)检测为嗜肺军团菌感染患者的抗感染治疗过程,协助医师调整抗感染治疗方案,识别药品不良反应。结果:经治疗患者感染症状得到控制,病情好转出院。结论:临床药师参与重症嗜肺军团菌肺炎患者的抗感染治疗,有助于提高临床用药的安全性及有效性。

妊娠期阴道菌群变化与胎膜早破的相关性

目的通过对正常妊娠与胎膜早破孕妇的阴道微生物群落分析,阐明阴道菌群变化与胎膜早破的相关性。方法随机收集符合纳入标准的不同孕周阶段胎膜早破孕妇阴道分泌物50例为实验组,正常孕妇阴道分泌物30例为正常对照组,提取细菌DNA后用高通量测序技术,分析比较胎膜早破与正常孕妇阴道微生物群落的多样性指数及群落结构。结果各组的Alpha多样性丰富度及均匀度指数,差异无统计学意义(P>0.05),各组菌群非度量多维尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)Stress=0.02,差异具有统计学意义(P<0.05)。根据维恩图显示未足月胎膜早破组的物种多样性最高,为529个;未足月正常对照组组的多样性最低,为207个。结论正常孕期阴道菌群较稳定,Alpha多样性小,Beta多样性显著。妊娠期阴道微生物群落以卷曲乳杆菌为主,若孕期阴道内菌群多样性增加,惰性乳杆菌、加德纳菌、纤毛菌、普氏菌、奇异菌等异常增加,易发生细菌性阴道病、胎膜早破。