T. pyogenes PLO蛋白单克隆抗体的制备与AC-ELISA方法的建立

为了建立可以定量检测化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)培养上清液中PLO蛋白含量的方法,试验首先制备针对毒力蛋白PLO分子第4结构域(D4)的单克隆抗体,然后应用筛选出的最佳捕获抗体,并结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的靶向PLO分子第2结构域(D2)的单克隆抗体(HRP-AP-1A3)建立一种用于检测PLO蛋白含量的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法,计算该方法的检测线,选择8种非T.pyogenes菌株验证该方法的特异性,绘制AC-ELISA方法的标准曲线,并应用该方法定量检测T.pyogenes HLJ-0912菌株培养上清液中wtPLO蛋白含量。结果表明:通过制备获得的5种单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8、3C7对PLO蛋白均具有良好的特异性,其中单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8是IgG2b亚型,均具有较强的抗溶血活性,靶向表位1(VEAGEATGLAWDPWWT);而单克隆抗体3C7是IgG1亚型,抗溶血活性非常弱,靶向表位2(KGTTLNPWVEDNVKS)。筛选出的最佳捕获抗体为单克隆抗体2G3,建立的AC-ELISA方法的最低检测限(OD_(450)值)为0.19。应用建立的AC-ELISA方法检测T.pyogenes HLJ-0912菌株的培养上清液为阳性,OD_(450)值为0.21;检测8种非T.pyogenes菌株的培养上清液均为阴性,OD_(450)值<0.19。标准曲线的方程为y=809.04x^(2)-85.695x,相关系数(R^(2))为0.999,拟合度较高。经AC-ELISA方法测定,在10,12,14小时时采集的T.pyogenes菌株培养上清液的OD_(450)值均高于最低检测限,培养上清液中的wtPLO蛋白含量分别为416.67,499.43,272.57 ng/mL。说明试验成功制备了针对PLO分子第4结构域的单克隆抗体,建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性。

POU4F3表达对118例肺腺癌患者预后评估及对肺腺癌细胞株迁移的影响

目的揭示POU结构域第4类转录因子3(POU4F3)在肺腺癌组织的表达及其与肺腺癌患者预后的关系,并探索POU4F3对肺腺癌细胞迁移的作用。方法免疫组织化学染色检测人肺腺癌及其癌旁组织(样本量均为118)中POU4F3的表达水平。利用Log-rank(Mantel-Cox)检验POU4F3表达水平与总生存期的关联性。以肺腺癌株为实验对象,构建稳定过表达(Lv-POU4F3)及其对照(Lv-control)或敲低POU4F3(shPOU4F3)及其对照(control shRNA)的慢病毒载体并分别转染至SPCA1和A549细胞系,Western blotting验证POU4F3过表达或敲低转染效率。运用划痕实验、Transwell迁移实验和鬼笔环肽荧光实验检测细胞迁移能力。结果免疫组化分析显示,118例肺腺癌组织中POU4F3的表达评分低于118例癌旁组织评分(1.5 vs 4.0),差异有统计学意义(P<0.001)。与POU4F3低表达肺腺癌患者相比,POU4F3高表达患者的总生存期延长(HR=2.04,95%CI:1.158~3.607,P=0.028)。细胞实验结果显示,有效构建了过表达或敲低POU4F3的稳定转染肺腺癌细胞株。过表达POU4F3后,划痕实验表明,Lv-POU4F3组细胞划痕愈合率低于Lv-control组,差异有统计学意义(F_(SPCA1处理)=69.86,P_(SPCA1)=0.001;F_(A549处理)=492.10,P_(A549)<0.001);Transwell迁移实验表明,SPCA1-Lv-POU4F3组穿膜细胞数少于SPCA1-Lv-control组(599.0±11.36 vs 806.3±18.72,t=16.40,P<0.001),A549-Lv-POU4F3组穿膜细胞数少于A549-Lv-control组(181.0±18.68 vs 314.7±23.46,t=7.72,P=0.002);鬼笔环肽荧光实验表明,过表达POU4F3后,SPCA1细胞微丝变细、伪足较少,Lv-POU4F3组的平均荧光强度低于Lv-control组(23.30±1.34 vs 33.45±1.85),差异有统计学意义(t=7.67,P=0.002)。敲低POU4F3后,划痕实验表明,shPOU4F3组细胞划痕愈合率高于control shRNA组,差异有统计学意义(F_(SPCA1处理)=114.60,P_(SPCA1)<0.001;F_(A549处理)=1 710.00,P_(A549)<0.001)。Transwell迁移实验表明,SPCA1-shPOU4F3组穿膜细胞数多于SPCA1-control shRNA组(970.00±14.53 vs 585.00±25.53,t=22.70,P<0.001),A549-shPOU4F3组穿膜细胞数多于A549-control shRNA组(528.00±29.14 vs 185.30±9.50,t=19.37,P<0.001);鬼笔环肽荧光实验表明,敲低POU4F3后,SPCA1细胞微丝变粗、伪足增多,shPOU4F3组的平均荧光强度高于control shRNA组(48.53±3.30 vs 31.07±2.32),差异有统计学意义(t=7.50,P=0.002)。结论 POU4F3在人肺腺癌患者癌组织中表达低于癌旁组织,POU4F3高表达者预后较佳,且POU4F3能够抑制肺腺癌细胞迁移。POU4F3可能是LUAD的抑癌基因并有望成为诊断和治疗LUAD的新靶标。