基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

RhCE抗原基因分型和表型不一致与等位基因变异的相关性研究

目的探讨变异RhCE抗原的分子背景及RHCE基因的遗传学特征与基因多态性。方法采用单克隆抗-C、-c、-E和-e试剂检测10 373例RhD阳性和635例RhD阴性献血者的RhCE表型;选择942例标本PCR-SSP技术做RHCE基因分型,对基因分型与血清学分型不一致标本采用PCR-SSP检测22个主要RHCE变异等位基因,部分RHCE等位基因采用测序技术鉴定。结果共有54例标本(占94.27%)基因分型结果与血清学表型结果不一致,经PCR-SSP检测出22种与弱表达抗原相关的RHCE等位基因变异体,经血清学复检有36例标本RhCE抗原存在弱反应或极弱反应。结论在血清学检测时表达弱反应的RhCcEe抗原标本中检出多种RHCE等位基因类型,变异的等位基因可以影响基因分型预测血型抗原的准确性:RhCE表型和基因型不一致的原因可能由变异的等位基因或未发现的等位基因引起。

幼年型与成年型强直性脊柱炎HLA*B等位基因高分辨分型研究

目的 通过对幼年型强直性脊柱炎(JAS)和成年型强直性脊柱炎(AAS)患者HLA*B等位基因进行高分辨测序分型,了解HLA-B基因多态性与JAS是否有相关性。方法 收集2019年8月—2021年12月就诊于本院的符合JAS和AAS患者各50例,采用PCR-SBT法对HLA*B位点特异性扩增,再使用ABI 3100毛细管测序仪对外显子1正向测序,外显子2、3、4、5同时进行正反向测序,采用uTYPETMHLA测序分析软件处理测序结果。结果 JAS组中男41例,女9例,AAS组中男43例,女7例,两组男女性别比例差异无统计学意义(P=0.585);JAS组发病年龄(12.5±2.9)岁,显著低于AAS组的(29.7±6.8)岁(P<0.001)。JAS组检出HLA-B*27纯合子5例占10.0%,AAS组检出HLA-B*27纯合子4例占8.0%,JAS组中45例杂合子中B*27:04、B*27:05、B*27:15、B*27:86分别为34例、6例、3例、2例,AAS组46例杂合子中B*27:04、B*27:02分别为45例、1例;HLA-B*27阳性的JAS和AAS各检出15例HLA-B*40,高分辨分型中以B*40:01:02为主要亚型。结论 HLA-B*27纯合子与等位基因HLA-B*40对JAS的早发病并无直接相关性。HLA-B*27:04是JAS和AAS主要基因亚型,HLA-B*27:05:02:01、HLA-B*27:15,在JAS中多于AAS组,携带该等位基因的患者倾向于早发。

HLA新等位基因B*46:30序列分析及其编码MHC蛋白分子结构预测与表型鉴定

目的:鉴定分析HLA新等位基因B*46:30序列,对其MHC蛋白分子三级结构及氨基酸残基改变对蛋白结构的可能影响进行模拟分析,并对其血清学表型进行鉴定。方法:应用Luminex SSOP流式、PCR-SBT及单等位基因特异性测序对HLA序列进行序列鉴定。应用SWISS-MODEL及RCSB PDB分析软件,对HLA序列蛋白分子三维结构进行模拟分析。HistoCheck、FATCAT对比分析蛋白分子间差异。使用Terasaki分型板进行血清型表型鉴定。结果:相较于B*46:01,新等位基因B*46:30第559、560位发生C->G、T->A替代。MHC分子结构预测分析表明,B*46:30第163位氨基酸残基由疏水性脂肪族亮氨酸Leu→B*46:30带负电荷的酸性谷氨酸Glu,R值为32。该氨基酸变异位置位于α2结构域构成抗原多肽结合凹槽侧壁的α螺旋顶端,总差异值DSS Score=1.32,均方根偏差RMSD=0.59?,血清型表型检测为B46强阳性。结论:HLA新等位基因序列被WHO HLA命名委员会正式命名为B*46:30,分析预测此编码氨基酸残基改变将可能影响其抗原多肽结合功能,并影响其与TCR及抗体的结合特性,血清型表型鉴定为B46。

中国北方汉族人群HLA-DQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性分析

目的 调查中国北方汉族人群HLA-DQA1、-DQB1、 HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性。方法 选取2016年中华骨髓库造血干细胞志愿者1 004人的外周血样,采用第2代测序方法(next generation sequence,NGS)进行HLA-DQA1、-DQB1、HLA-DPA1、-DPB1等位基因分型。结果 1 004人份样本中,共检出24种HLA-DQA1、20种HLADQB1、12种HLA-DPA1、40种HLA-DPB1等位基因。各位点频率较高的前3种等位基因依次为HLA-DQA1^(*)01:02:01(15.2%),HLA-DQA1^(*)03:02:01(15.2%),HLA-DQA1^(*)05:05:01(8.0%);HLA-DQB1^(*)03:01:01 (19.0%),HLA-DQB1^(*)03:03:02(16.2%),HLA-DQB1^(*)05:02:01(11.2%);HLA-DPA1^(*)02:02:02(52.2%),HLA-DPA1^(*)01:03:01(33.0%),HLA-DPA1^(*)02:01:01(10.3%);HLA-DPB1^(*)05:01:01(37.0%),HLA-DPB1^(*)02:01:02(17.6%),HLA-DPB1^(*)04:01:01(10.0%)。HLA-DQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1之间的单体型存在连锁不平衡。结论 获得北方汉族人群HLADQA1、-DQB1和HLA-DPA1、-DPB1等位基因多态性数据和单体型数据,可为器官移植、群体遗传学和疾病关联研究等提供重要参考数据。

利用动态等位基因特异性杂交技术进行单核苷酸多态高通量分型

动态等位基因特异性杂交 (dynamicallele specifichybridization ,DASH)是新发展起来的一种单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)等位基因分型技术 ,具有快速、经济、准确、高通量、重复性好等优点 .利用DASH技术 ,对 96份正常人外周血DNA样品成功地进行了两个SNP位点的基因分型 ,并摸索实验条件 。

B(A)血型等位基因分型研究

目的了解血清学定型为B(A)血型标本的分子基础。方法采用PCR-SSP方法检测以血清学方法定型为B(A)血型的4名献血者和8例送检患者标本的ABO基因型;对于有O等位基因的杂合子标本,使用特异性引物分别扩增O和B等位基因的7号外显子编码序列,并做测序分析。结果 12例采用血清学方法定为B(A)血型标本的ABO基因型分别为B/B型1例(8.33%),B/O1型4例(33.33%),B/O2型7例(58.33%);序列分析显示:B(A)02等位基因为5例(41.67%),B(A)04等位基因为7例(58.33%)。结论 B(A)04和B(A)02等位基因可能是我国北方汉族人群B(A)血型中主要的遗传类型。

HLA-B40组等位基因多态性和血清学分型不明确标本分析

目的 利用DNA分型技术调查上海汉族人群HLA-B40组等位基因多态性并比较配型标本中HLA-B40抗原血清学和DNA分型的结果。方法 采用反向PCR-SSOP技术进行DNA分型,可检出HLA-B＊4001-4011等11个等位基因。结果所有样本DNA分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现。质控DNA分型结果与UCLA结果相符。上海地区汉族人群共检出B＊4001-4003、4005-400、4011等等位基因,未检出B＊4004、4008-4010等等位基因。296名无关个体中HLA-B40＊组等位基因频率为0.140 2。血清学方法检测HLA-B40组抗原错误率为12.82％（10/78）。结论 该技术用于HLA-B40分型分辨率高,分型结果较血清学方法更加精确,可确保HLA分型的准确。

肾移植供受者DR4-DRB1等位基因的分型

目的研究HLA DRB1等位基因的分型配合 ,因为相配的肾移植 ,其急性排斥反应的发生率明显降低 ,移植肾的存活时间明显延长。方法我们合成了一对DR4特异性引物 ,对DR4阳性的肾移植供受者的DNA样品进行PCR扩增后 ,将PCR产物分别用限制性核酸内切酶SacII,AvaII ,HinfI,HaeII ,HphI和MnlI进行酶切。结果根据酶切结果及RFLP图型 ,可将DR4进一步分为DR4 DRB1 0401～0411。结论本方法快速、简便、精确 ,可为肾移植中DR4阳性供受者HLA DRB1等位基因的配型提供可靠的方法。

PCR-SSP基因分型技术检出HLA-B新等位基因B＊5516一例

目的 识别确认中国人群的HLA新等位基因。方法 使用PCR SSP以及以测序为基础的分型技术 ,分析HLA新等位基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异及血清学方法分析特异性。结果 在四川成都骨髓供者中检测出一例新的HLA B等位基因。该基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异 ,只是在外显子 2区域中 97C >A一个碱基取代 ,导致相应的密码子 33由酪氨酸变为组氨酸。血清学分析表明B 5 5 16与B2 2特异性相关。并由此建立起PCR SSP方法鉴定B 5 5 16基因。结论 四川成都骨髓库中检出的HLA B等位基因是HLA新等位基因 ,2 0 0 3年 8月已被世界卫生组织 (WHO)命名为HLA B 5 5 16。在大约 14 0 0例随机骨髓供者中 ,未发现其他带有B 5 5 16基因的个体。

等位基因特异性扩增法在SNP分型中的研究进展

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)因其分布广、数量大而在疾病研究特别是多基因疾病研究领域显示出巨大的优势,因此临床研究和诊断需要一种快速、简易、准确、经济的SNP检测方法。近年来,等位基因特异性扩增法(Allele-specific polymerase chain reaction,AS-PCR)因其操作简单、成本低廉和结果准确而在SNP检测领域显示了巨大应用潜力,并受到越来越多相关科研和医务工作者的关注。系统的对AS-PCR技术在SNP分型中的研究进展和应用作了全面综述,对其发展方向和应用前景进行了展望。认为通过与其他检测平台联合,AS-PCR可促进SNP检测技术由实验室向临床应用转化的进程,为诸多疑难疾病的防治提供新的思路和参考。

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的 采用分子克隆技术大量制备优质标准 STR基因座等位基因分型标准物 ,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题。方法 先用 PCR扩增出 Y染色体上 DYS385基因座的 9个等位基因片段 ,将其插入 p U C重组质粒中 ,经 DNA测序分析证实插入片段的结构及大小 ,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名 ,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的 DYS385等位基因分型标准物。结果 应用此法制备出大量的 DYS385等位基因分型标准物 ,并将其成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论 该法制备的 STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高 。

慢性再生障碍性贫血中医辨证分型与MHC-DRB1*等位基因的相关性研究

目的:探讨慢性再生障碍性贫血中医辨证与MHCDRB1*等位基因多态性之间的关系。方法:采用聚合酶链式反应/序列特异性引物的技术方法,对慢性再生障碍性贫血(CAA)患者和对照组的MHC-DRB1*各等位基因进行检测和分析。结果:肾阳虚型组患者MHC-DRB1*0301基因频率明显高于健康对照组,两组差异有非常显著性(P<0.01)。MHCDRB1*各等位基因未见与CAA肾阴虚型相关。结论:MHCDRB1*0301基因可能是CAA肾阳虚型的易感基因,或者也可能是CAA的易感基因或其一部分,表明该型患者的免疫调控缺陷遗传基础的存在。MHC与CAA的先天体质疾病类型之间有一定的内在联系,能在一定程度上反映中医体质的遗传特征和CAA中医辨证的客观性。

分子克隆技术制备miniSTR基因座等位基因分型标准物

目的调查D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D2S1776共5个miniSTR基因座在河北汉族人群中的遗传多态性,并用分子克隆的方法制备等位基因分型标准物。方法用荧光PCR和ABI310遗传分析仪对河北汉族120份无关个体血样中的5个miniSTR基因座进行遗传多态性分析。用分子克隆的方法构建等位基因分型标准物。结果5个基因座在河北汉族人群中分别检测出了8、8、7、5和8个等位基因,多态信息含量分别为0.790、0.720、0.750、0.630和0.850。结论5个基因座在河北汉族人群中有较高的多态信息含量,其分子克隆法制备的等位基因分型标准物具有较高的法医学应用价值。

海南省恶性疟原虫MSP1和MSP2等位基因分型研究

目的 对海南省恶性疟原虫分离株的裂殖子表面蛋白质 1(MSP1)和裂殖子表面蛋白质2 (MSP2 )基因进行分型研究。方法 从海南省恶性疟流行区采集的恶性疟患者血样 ,用套式PCR方法分别扩增PfMSP1和PfMSP2基因中具有型特异性的片段 ,进行等位基因分型。结果 (1)MSP1基因分型 :94份恶性疟患者血样中有 82份扩增出MAD2 0型基因片段 (占 87 2 % ) ,2 7份扩增出K1型基因片段 (占 2 8 7% ) ,15份同时扩增出MAD2 0型和K1型基因片段 (占 16 0 % ) ,未扩增出RO33型基因片段。 (2 )MSP2基因分型 :94份血样中有 75份扩增得到 3D7型基因片段 (79 8% ) ,2 8份扩增得到FC2 7型基因片段 (2 9 8% ) ,10份同时扩增得到 3D7型和FC2 7型基因片段 (占 10 6 % )。结论 海南省恶性疟原虫的MSP1等位基因和MSP2等位基因分别以MAD2 0型和 3D7型为优势基因型 ;

STR分型中无效等位基因的分析研究

PCR-STR自动分型技术是当前法医学个体识别和亲权鉴定的主要技术,具有高灵敏度、高鉴别能力和标准化自动分型等特征[1].在STR自动分型时,也会出现一些影响其准确分型的因素,本文结合1例三联体亲权鉴定中父亲与孩子Penta基因座上不符合遗传规律现象,通过用3种不同试剂盒、改变退火温度、重新设计引物以及测序等方法,对STR分型中无效等位基因现象进行分析和探讨.

DXS6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究

目的用分子克隆技术制备DXS6804基因座等位基因分型标准物,并用于中国云南普米族人群的群体遗传学研究,解决长期困扰短串联重复序列分型上存在的准确性和标准化问题。方法用PCR扩增出DXS6804基因座的各等位基因片段,PCR产物克隆后,DNA测序证实插入片段的大小和结构,按国际标准进行命名后,经扩大培养、扩增及再鉴定后,制备出该基因座的等位基因分型标准物,进行群体研究。结果调查了中国云南地区普米族人群基因座的基因型分布频率,发现DXS6804基因座两个分型标准物外等位基因。结论分子克隆技术是制备等位基因分型标准物的可靠方法,DXS6804基因座是一个适合我国法医学和群体遗传学分析的遗传标记。

用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序法制备DXS9898基因座等位基因分型标准物

目的:探索一种快速制备X染色体短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因座等位基因分型标准物的简便方法。方法:采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)切胶回收-二次PCR-测序的方法制备X-STR基因座等位基因分型标准物。结果:应用此法制备出大量的DXS9898基因座等位基因分型标准物。结论:利用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序制备STR基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法。

神经纤维瘤病Ⅰ型患者HLA-DRB1位点等位基因的测序分型

目的 进行神经纤维瘤病Ⅰ型患者的HLA DRB1位点等位基因高分辨率测序分型 ,探讨HLA与神经纤维瘤病发病之间的关系。方法 应用聚合酶链反应 直接测序方法 (PCR SBT) ,对 3 0例神经纤维瘤病Ⅰ型患者及 10 8例正常人进行HLA DRB1位点等位基因分型。结果 神经纤维瘤病Ⅰ型患者HLA DRB1 0 40 6位点等位基因以较高频率出现 ,与对照组比较差异有显著性。结论 HLA DRB1位点等位基因频率在神经纤维瘤病Ⅰ型患者和正常人之间分布不同。

用分子克隆技术构建D12S375基因座等位基因分型标准物及汉、回、维族群体遗传学研究

采用分子克隆技术大量制备STR基因座等位基因分型标准物 ,解决长期困扰STR分型的准确性和标准化问题。PCR扩增出D12S375基因座的 7个等位基因片段 ,将其插入pUC重组质粒中 ,经DNA测序分析证实插入片段的结构及大小 ,按重复单位的重复次数对插入的等位基因片段进行命名 ,最后经转染、扩增及再鉴定后制备出标准D12S375基因座等位基因分型标准物。应用此分型标准物 ,调查D12S375基因座在成都汉族 ,甘肃回族及新疆维族群体中的基因型分布频率 ,评估其在法医学实践中的应用价值。