用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-PCR快速检测抗多菌灵的油菜菌核病菌

通过3对兼并性引物扩增获得与S.sclerotiorum抗药性相关的β-微管蛋白基因,全长1 685 bp,包含4个内元,相应的编码447个氨基酸。该基因与其它6种线状真菌的β-微管蛋白基因相比,氨基酸序列同源性达95.78%～97.66%,但内元数目和大小不同。比较S.sclerotiorum敏感型和抗药性菌株的β-微管蛋白基因,发现该基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸,从而导致田间抗药性的产生。为了快速、准确监测田间抗药性频率,根据S.sclerotiorumβ-微管蛋白基因的突变位点设计了2对等位基因特异性寡核苷酸(ASO),直接以菌核的基因组DNA为模板扩增,所需时间约为6 h,抗药性检出率为100%,与传统菌丝直径法的测定结果相比检测准确率为96%,而传统的检测方法至少需要1～2周。

基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

即时定量PCR法和等位基因特异性寡核苷酸PCR法检测肺腺癌EGFR基因第21号外显子L858R突变的对比性研究

自从Lynch等和Paez等发现肺癌细胞中上皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶编码区基因突变以来，研究证明具有EGFR基因第19号外显子（del746-A750）缺失突变或第21号外显子L858R错义突变的肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼进行分子靶向治疗的有效率高达80％以上，而对于缺乏EGFR突变的患者采用上述治疗则基本无效。

基于等位基因特异性PCR技术检测Sw-5b基因

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是世界范围内危害最大的病毒病之一。为了加快番茄抗TSWV育种进程,利用等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR,AS-PCR)技术建立了与TSWV抗性基因Sw-5b连锁的标记。结果表明:在63℃退火温度下,引入A-C错配的特异性引物rg3-F可以检测出抗性基因型。没有引入错配的特异性引物sg1-F,在60℃退火温度下可以检测出感病基因型。在验证试验中,利用引物Sw5b-f1/r1进行PCR扩增并测序,结果表明利用rg3-F和sg1-F进行AS-PCR,能够有效区分番茄的不同基因型。本研究建立的AS-PCR方法为育种工作者在番茄抗TSWV育种中筛选Sw-5b抗性基因提供了有力的工具。

利用动态等位基因特异性杂交技术进行单核苷酸多态高通量分型

动态等位基因特异性杂交 (dynamicallele specifichybridization ,DASH)是新发展起来的一种单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)等位基因分型技术 ,具有快速、经济、准确、高通量、重复性好等优点 .利用DASH技术 ,对 96份正常人外周血DNA样品成功地进行了两个SNP位点的基因分型 ,并摸索实验条件 。

利用等位基因特异性PCR检测水稻可溶性淀粉合酶基因的单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(SNP)广泛分布于水稻基因组中,SNP分型已成为水稻遗传作图、关联分析、资源鉴定和分子标记辅助选择等研究的重要技术。本文选择水稻可溶性淀粉合酶基因SSIIIa的12个SNP位点,研究了利用等位基因特异性PCR法检测SNP的可行性。按照等位基因特异性PCR原理设计引物3'末端碱基,并根据每个SNP位点引物3'端的错配类型,在上游引物3'末端第3位引入不同的错配碱基,结果均获得了很好的扩增特异性,PCR检测结果与测序结果吻合。表明,等位基因特异性PCR是一种简便、快捷、可靠和低成本的SNP分型方法,可有效应用于水稻可溶性淀粉合酶基因的种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种等相关研究。

多重等位基因特异性扩增--微流控芯片电泳法同时测定多个单核苷酸多态性位点

文章以微流控芯片电泳为检测平台,建立了一种基于DNA适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增同时测定多个单核苷酸多态性(SNP)位点的方法。以白细胞介素1β(IL1B)基因中的7个SNP位点(794C>T、1274C>T、2143T>C、2766T>del、3298G>A、5200G>A和5277C>T)为检测对象,通过PCR预扩增得一段含该7个待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶MboⅠ将其消化成短片段,再与DNA适配器(adapter)相连;以连接产物为模板,在两管中分别用7条等位基因特异性引物和一条公用引物进行7重等位基因特异性扩增;最后用微流控芯片电泳法分离等位基因特异性扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。采用本法成功测定了48名健康中国人的IL1B基因上的7个SNP位点,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)和测序法测定结果完全一致。本法结果准确,可用于同时测定多个SNP位点;以微流控芯片电泳作为检测平台,分析速度快,样品需要量少;借助于自制筛分凝胶和重复使用芯片,使得SNP分析成本大大降低。

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP)。方法:以TYR基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型。结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYR基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致。结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点。

科学家研究解析苹果转座子插入调控等位基因特异性表达

中国农业科学院果树研究所苹果资源与育种创新团队联合国内外科研机构,从全基因组层面上阐释了苹果转座子(TE)在调控等位基因特异性表达(ASE)方面的重要作用。相关研究成果发表在《植物生物技术杂志》。

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primerpremier5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用PrimerPremier5.0和Oligo6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40merOligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。

基于等位基因特异性PCR原理建立的SNP分型新方法

目的建立一种新方法,对多个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点进行分型。方法基于等位基因特异性PCR原理,采用荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术,根据PCR片段长度差异进行分型。选择SNP位点共11个,每个SNP位点设计两条长度不同、3’末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时为了增加特异性,在两条等位基因上游引物的3’末端第3或第4位碱基人为引入错配。在距离上游引物100～300bp范围内的合适位置,设计下游共用引物,并进行荧光标记。所有位点经过复合扩增后,PCR产物经ABIPrismTM310型遗传分析仪电泳分离,确定每个SNP的基因型。结果每个SNP位点纯合子为单一产物峰,杂合子则为长度不同的两个产物峰。不同的SNP位点扩增产物长度不同,根据产物长度和产物峰的数量进行SNP分型,一次完成11个SNP位点分型,其结果与直接测序完全一致。结论荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法是一种简单快速而有效的SNP分型新方法。

应用等位基因特异性PCR和多重差别PCR检测肺癌患者CYP1A1和GSTM1的遗传多态性

本文对等位基因特异性ＰＣＲ（Ａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＡＳ）和多重差别（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ，ＭＤ）ＰＣＲ技术进行了优化，并用此法联合检测了１０５例江苏地区健康人群及６８例肺癌患者ＣＹＰ１Ａ１、ＧＳＴＭ１的等位基因型。结果表明：ＡＳＰＣＲ及ＭＤＰＣＲ采用的设立双参照扩增体系，可一次同时检测ＣＹＰ１Ａ１和ＧＳＴＭ１的等位基因型。在肺癌患者组中，ＣＹＰ１Ａ１的突变型Ｖａｌ／Ｖａｌ的频率１２／６８（１７．６％）约为健康组９／１０５（８．５７％）的２０５倍，而ＧＳＴＭ１纯合缺失的频率，肺癌组为３９／６８（５７３％），与健康对照组４２／１０５（４０％）相比，亦有显著增加（Ｐ＜０．０５）。

人工修饰双等位基因特异性引物扩增法检测CYP1B1多态性与肺癌易感性的关系

[目的 ]应用一种新的快速检测单核苷酸多态性 (SNP)方法———人工修饰双等位基因特异性引物扩增 (di ASA AMP)法研究CYP1B1基因Leu43 2Val位点多态性与江苏汉族人群肺癌易感性的关系。 [方法 ]采用配对病例 对照研究 ,收集江苏汉族人群原发性肺癌患者 2 2 7例为病例组 ,同时按 1∶1配对选择非肿瘤、非呼吸道疾病患者 2 2 7例为对照组。应用diASA AMP方法检测了病例组与对照组CYP1B1基因Leu43 2Val位点多态性 ,分析Leu43 2Val位点突变与肺癌易感性之间的关系。并应用测序法验证diASA AMP法的特异性。 [结果 ]CYP1B1基因Leu43 2Val位点突变C和G的基因频率在对照组和病例组的分布差异无显著性 ( χ2 =0 .2 0 1,P >0 .0 5 ) ,单纯CYP1B1基因Leu43 2Val位点突变与肺癌危险性也不存在明显的相关关系 (OR =1.0 85 ,95 %CI =0 .73 0～ 1.615 ) ,但该位点突变与吸烟可能有一定协同作用 ,携带G等位基因的基因型可增加吸烟者患肺癌的危险性 (OR =2 .0 5 7,95 %CI =1.162～ 3 .64 2 )。对照组的CYP1B1C和G等位基因频率与现有的中国汉族人群资料结果相近 ,测序结果与diASA AMP结果相符。 [结论 ]CYP1B1Leu43 2Val多态性可能是江苏汉族人群吸烟者肺癌发生的易感因素。diASA

等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的 :研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系 ,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法 :通过美国国家生物信息中心 (NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5 .0软件设计引物 ,并经NCBI的Blast2 .0软件检验其特异性。结果 :建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP -PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP—PCR)两种技术 ,并应用于 β2 肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究 ,证实该技术的稳定性和优越性。结论 :等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法 。

等位基因差异特异性PCR检测HBVDNA的前C区1896突变位点及其临床意义

为了探讨ＨＢＶ前Ｃ区 １８９６突变位点检测的临床意义，采用３－末瑞等位基因差异特异性ＰＣＲ方法对９５例乙型肝炎病毒感染者的ＨＢＶＤＮＡ１ ８９６位点进行基因型（野生株／突变株）的检测，结果显示：总突变率为６４．２％，总野生率为５５．８％，纯野生型和纯突变型的检出率分别为２８．４％和２７．４％；不同临床类型的乙肝病毒感染者均可出现突变，其野生型、突变型和混合感染型的检出率之间的比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），急性乙肝与慢性乙肝、携带者、肝硬化和肝癌的总突变率存在差异（Ｐ＜０．０５）；血清不同ＨＢｅ系统均可发生突变．抗－ ＨＢｅ阳性组的突变率显著高于ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｅ系统阴性组（Ｐ＜０．０５），提示：机体感染了ＨＢＶ后．变异主要是发生在慢性持续性感染过程中．突变株逐渐替代了野生株并成为优势株．使宿主得以持续感染ＨＢＶ。

应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变

目的:建立检测胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因6种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中CETP基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA3种基因型,I405V(A→G)突变位点可检测出AA、AG、GG3种基因型,D442G(A→G)突变位点可检测出AA、AG2种基因型,但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型,用等位基因特异性PCR鉴定的CETP基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定CETP基因突变类型的可行方法。

片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

等位基因特异性扩增法在SNP分型中的研究进展

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)因其分布广、数量大而在疾病研究特别是多基因疾病研究领域显示出巨大的优势,因此临床研究和诊断需要一种快速、简易、准确、经济的SNP检测方法。近年来,等位基因特异性扩增法(Allele-specific polymerase chain reaction,AS-PCR)因其操作简单、成本低廉和结果准确而在SNP检测领域显示了巨大应用潜力,并受到越来越多相关科研和医务工作者的关注。系统的对AS-PCR技术在SNP分型中的研究进展和应用作了全面综述,对其发展方向和应用前景进行了展望。认为通过与其他检测平台联合,AS-PCR可促进SNP检测技术由实验室向临床应用转化的进程,为诸多疑难疾病的防治提供新的思路和参考。