实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪)

较为全面地论述了聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪)。较为详细地阐述了PCR基本原理、PCR结果的检测与分析、实时定量PCR技术、影响PCR效果的因素、PCR技术的应用、PCR仪器的现状及其发展方向。

实时荧光核酸恒温扩增技术和实时荧光定量聚合酶链反应检测解脲脲原体的效果比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)在解脲脲原体(UU)检测中的效果,以选择更为准确和快速的临床检验方法。方法选择2018年1月—2020年1月在福建中医药大学附属福鼎医院就诊的89例临床疑似UU感染患者作为研究对象,同时使用SAT和qRT-PCR检测所有患者尿液和分泌物样本。比较两种方法的阳性检出率、敏感度、特异度、准确度。结果SAT的阳性检出率明显高于qRT-PCR〔69.7%(62/89)比51.7%(46/89),P<0.05〕;SAT和qRT-PCR检测的敏感度分别为100.0%、78.0%,特异度分别为90.0%、100.0%,准确度分别为96.6%、85.4%,阳性预测值分别为95.2%,100.0%;阴性预测值分别为100.0%、69.8%。结论SAT对疑似UU感染的标本检测阳性率较高,有助于快速、准确筛查,值得临床推广。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

等位基因特异扩增实时定量PCR检测新生儿高胆红素血症相关基因SLC01B1 A388G多态性

目的建立检测高胆红素血症相关基因SLC01B1 A388G多态性位点的等位基因特异扩增实时定量PCR（allele-specific real-time PCR，ASPCR）方法，用于临床样本的检测和分析。方法针对SLC01B1基因A388G多态性位点设计引物，建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品，并选取50例临床样本，其中已确诊并存在SLC01B1基因A388G突变的新生儿高胆血红素症病例30例，不存在SLC01B1基因A388G突变的健康新生儿20例，使用特异性引物和非特异性引物分别检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本，根据二者Ct（cycle threshold）值判断是否存在A388G多态性位点。评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差（△Ct）可达13．97±0．75，ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒，Probit回归分析显示其灵敏度可以达到5．28拷贝／μL。临床样本存在A388G突变的Ct值均远小于37．75，为阳性结果；不存在A388G突变的未见任何扩增或Ct值大于37．75，可判为阴性。结论ASPCR是一种快速、简便、有效的检测临床样本SLC01B1基因A388G多态性位点的方法，可用于大样本筛查新生儿高胆红素血症基因位点。

等位基因特异扩增实时定量PCR检测HIV的V106I耐药突变位点的方法建立

目的建立等位基因特异扩增实时定量聚合酶链式反应(ASPCR)检测艾滋病病毒(HIV)V106I耐药突变位点的方法,用于快速检测低比例的V106I突变。方法针对HIV的V106I多态性位点设计引物,建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品,检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果 5份接受抗病毒治疗的HIV感染者本底血清标本(2份存在V106I耐药突变位点,3份不存在V106I耐药突变位点),特异性引物扩增105野生型质粒和突变型质粒的循环阈值(Ct值)之差(△Ct)为10.26,ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒,临界值为9.26;对100%~0.01%的突变型质粒和野生型质粒混合物的检测显示,突变比例高于1%时得到相应的ΔCt值均<9.26,根据标准曲线计算出的突变比例与理论值具有较好的吻合度,ASPCR法检测V106I突变的灵敏度可达到1%突变比例。结论建立的ASPCR方法可用于检测临床样本V106I耐药突变位点。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体的临床价值分析

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测解脲脲原体(UU)的临床价值。方法选取2018年5月至2020年5月于本院就诊的疑似泌尿生殖道感染患者80例,采集所有受检者的尿道/宫颈口拭子及尿样标本,分别采用液体培养法、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法、SAT法检测拭子标本中UU阳性表达情况,以液体培养法结果为金标准,评估SAT技术在UU检测中的临床价值。结果液体培养法结果显示,80例患者中31例(38.75%)UU检测呈阳性,49例(61.25%)UU检测呈阴性;31例UU阳性患者中SAT(拭子)检出29例,检出率为93.55%,SAT(尿样)检出27例,检出率为87.10%,qRT-PCR检出28例,检出率为90.32%;3种检测方法检测UU阳性表达情况比较差异无统计学意义。SAT(拭子)、SAT(尿样)、q RT-PCR检测UU的灵敏度、特异度、误诊率、漏诊率、正确指数比较差异无统计学意义。结论实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体具有较高的灵敏度、特异度,且取材方便、检测快速、污染较低、结果准确,值得临床推广应用。

日本沼虾酚氧化酶原基因cDNA的全长克隆及表达分析

目的克隆日本沼虾酚氧化酶原(proPO)基因,进行生物信息学及时空表达分析。方法利用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(RACE)技术从血细胞中克隆proPO基因cDNA全长序列,用生物软件对其序列进行生物信息学分析;proPO基因时空表达分析采用RT-PCR和Real-time PCR方法;腹部肌肉注射嗜水气单胞菌(5.0×109/L)诱导酚氧化酶(PO),20μl/只,注射后3、6、12、24h取其血淋巴,分别测定血细胞proPO mRNA水平及血清酚氧化酶(PO)活力。结果日本沼虾proPO基因cDNA全长2428bp,包含71 bp的5’UTR、344 bp的3’UTR和2013bp的开放阅读框(ORF)。ORF编码671个氨基酸,预测蛋白分子量为76.5kD,理论等电点(pI)约为7.31;含有2个保守的铜离子结合位点和6个组氨酸残基、1个蛋白酶水解位点和硫酯样的基序(GCGWPRHM);含有3个血蓝蛋白结构域;与罗氏沼虾proPO的相似性最高,为93%,与其他甲壳动物proPO相似性为50%～53%。该基因表达具有组织特异性,血细胞最高,肝胰腺有较弱表达,肌肉、鳃、肠、大颚器官和卵巢不表达;血细胞proPO基因的表达量在蜕皮前期(D0/1)最高;嗜水气单胞菌刺激后6 h血细胞proPO mRNA水平及血清中PO活力均显著增加。结论与其他甲壳动物相似,日本沼虾proPO基因具有2个保守的铜离子结合位点;其表达呈组织特异性,最高出现在血细胞;在蜕皮周期的前期(D0/1)血细胞表达量最高;嗜水气单胞菌可诱导proPO基因的表达以及PO活力,提示该基因是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。

智能等温扩增方法建立乙肝病毒核酸检测体系及评估

目的:利用智能等温扩增方法(SMAP)建立乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测体系。方法:以pGEMX-T-X重组质粒为标准品,应用SMAP、实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)对标准品的连续梯度稀释样品和其他几种病毒核酸提取物进行对照试验,测定SMAP对HBV核酸检测的特异性与灵敏度。结果:HBV病毒SMAP检测体系,反应最短时间15min,最优反应时间30min,无特殊仪器要求,特异性好,灵敏度10copies/μl;HBV病毒Real-time PCR检测体系,反应时间约2h,需要实时荧光定量PCR仪,特异性好,灵敏度100copies/μl。结论:SMAP方法检测速度快,无特殊仪器要求,能够提高检查效率,降低诊疗成本,值得推广应用。

转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT-PCR的灵敏性差异和相关性,以及TMA临床应用的意义。方法:利用鼠白血病反转录酶(moloney murine leukemia virus,MMLV)、T7 RNA聚合酶及2条特异性引物等建立TMA扩增体系;通过HCV RNA的扩增曲线的相关性变化,评价不同储存温度对TMA扩增体系的稳定性和重复性的影响;通过扩增一组10倍梯度稀释的HCV RNA体外转录样本,评价TMA体系与RT-PCR的灵敏性差异。收集101份临床诊断为慢性丙型肝炎患者的血清,同时采用TMA试剂和RT-PCR试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用直线相关和回归探讨两种方法检测血清HCV RNA的相关性。结果:成功地建立了TMA扩增体系,该体系在室温下放置24 h,结果影响较大,但在4℃储存6 d,-20℃下储存6个月内扩增效果不受影响,稳定性良好。与湖南圣湘生物技术公司RT-PCR试剂检测结果的比较显示:31份血清标本TMA及RT-PCR均检测到阳性20例,阴性11例,检测一致率为100%。选取其中20例阳性标本进行定量分析,发现两种技术有很好的相关性(r=0.91,P<0.01)。与上海科华公司的RT-PCR试剂检测结果比较,发现在70份血清标本中,TMA检出RNA阳性标本数为34例,阴性标本数为36例,PCR检出RNA阳性标本数为32例,阴性标本数为38例,检测一致率为97.1%,两种检测方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中29例PCR检测和TMA检测均有定量结果的血清进行分析,两种技术也有很好的相关性(r=0.96,P<0.01)。结论:TMA检测试剂在-20℃下储存,6个月内稳定性和重复性良好。TMA与RT-PCR均能很好地检出血清中HCV RNA,两种技术有很好的相关性,定量检测有很好的可比性。

环介导等温扩增技术在SARS-CoV-2核酸检测中的应用研究

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的高度传染性导致全球SARS-CoV-2感染病例迅速增加。寻找一种较传统实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术更加准确、快速的检测方法对疾病确诊及疫情防控尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)与反转录酶相结合(RT-LAMP)已成功应用于SARS与中东呼吸综合征的检测,在SARS-CoV-2检测中亦表现出潜在优势。该文对SARS-CoV-2的结构特点、人类感染机制、LAMP的检测原理及其在SARS-CoV-2检测中的应用研究进展进行详细综述,以期为临床提供一种较RT-PCR更加快速、特异且具有明显成本-效益的SARS-CoV-2核酸检测方法。

转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。

核酸扩增试验筛查有助于防止严重急性呼吸综合征-冠状病毒的输血传播[英]／Schmidt M…／／Transfusion

已知引起严重急性呼吸综合征(SAILS)的病原体是SARS冠状病毒(SARS—CoV)，主要经飞沫或接触传播，对于它是否经输血传播知之甚少。为此，作者采用了一种实时定量聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒，利用核酸扩增试验(NAT)方法对献血员进行了大批量的检测。

桉树焦枯病菌内参基因的筛选

为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)的mRNA差异表达情况,并采用ge Norm软件分析了它们在两种条件下的表达稳定性。结果表明,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下表达最稳定的基因,且不需要引入第3个基因;18S rRNA和α-tubulin-1为侵染桉树叶片下表达最稳定的基因,但需引入第3个基因GAPDH。因此,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合的内参基因,而18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染桉树叶片较适合的内参基因。

AMSS-PCR在肺癌突变基因检测中的价值研究

背景与目的肺癌驱动基因检测具有重要意义,目前检测方法多样,临床适用性有差异。本研究旨在比较基于扩增阻碍突变系统-聚合酶链反应(Amplification Refractory Mutation System-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术的试剂盒与一代测序及ARMS-qPCR检测肺癌突变基因的敏感性和特异性,探究突变位点特异扩增法(Amplification Mutation Specific System, AMSS)-PCR技术在肺癌突变基因检测中的应用价值。方法对前期已行ARMS-PCR检测的肿瘤标本进行一代测序及试剂盒检测,比较各种方法的检测结果,并对检测结果进行统计学分析。结果本研究共收集了309例肺癌标本。试剂盒与一代测序符合率97.41%,ARMS-PCR的符合率97.73%。试剂盒与一代测序、试剂盒与实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)、qPCR与一代测序一致性检验的Kappa值分别为0.946、0.953、0.913。试剂盒以一代测序为参照的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristiccurve,ROC)曲线下面积为0.976,以qPCR为参照的ROC曲线下面积为0.975。结论 AMSSqPCR技术能够有效检测肺癌突变基因,具有较好的临床应用价值。

流感病毒核酸检测方法研究进展

流感病毒可以引起人和动物高度接触性传染性疾病,对公共卫生和畜禽养殖业均造成极大的威胁。因此,准确而又快速的诊断方法对流感的防控起着非常重要的作用。近年来,流感病毒的核酸诊断技术发展较快,主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等。论文对这些诊断技术的基本原理和应用现状进行了综述,并对其发展前景进行了展望。

PCR及其相关技术在感染性疾病诊断中的应用

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是上世纪八十年代由Mullis等[1]首次公开发表的一种DNA体外扩增技术。其发表后激发起了人们对这项技术的兴趣,并且由此翻开了分子生物学飞速发展的新篇章。然而刚开始时,人们对PCR技术并不看好。因为它不仅操作复杂,而且成本非常高,并不能得到普遍应用。