鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

用荧光双链引物特异扩增并定量核酸

描述了一种利用特殊的双链引物———突触引物 ,用于核酸扩增的特异定量检测 .在传统的引物的 5’端标记荧光物质 ,而在引物的互补序列的 3’端标记荧光淬灭剂以封闭其延伸 .二者杂交即成双链突触引物 .在制备PCR反应混合物阶段以及加热的初期 ,突触引物保持稳定的双链结构而不能引导扩增 ,在退火阶段 ,突触引物部分解链导致引物延伸 ,荧光物质与淬灭剂分开而产生荧光 .利用人 β珠蛋白基因对此方法进行了验证 .这种可自行退火的荧光引物不仅简单地实现了实时扩增 。

等位基因特异扩增实时定量PCR检测HIV的V106I耐药突变位点的方法建立

目的建立等位基因特异扩增实时定量聚合酶链式反应(ASPCR)检测艾滋病病毒(HIV)V106I耐药突变位点的方法,用于快速检测低比例的V106I突变。方法针对HIV的V106I多态性位点设计引物,建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品,检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果 5份接受抗病毒治疗的HIV感染者本底血清标本(2份存在V106I耐药突变位点,3份不存在V106I耐药突变位点),特异性引物扩增105野生型质粒和突变型质粒的循环阈值(Ct值)之差(△Ct)为10.26,ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒,临界值为9.26;对100%~0.01%的突变型质粒和野生型质粒混合物的检测显示,突变比例高于1%时得到相应的ΔCt值均<9.26,根据标准曲线计算出的突变比例与理论值具有较好的吻合度,ASPCR法检测V106I突变的灵敏度可达到1%突变比例。结论建立的ASPCR方法可用于检测临床样本V106I耐药突变位点。

RNA恒温扩增实时检测技术联合荧光定量PCR技术对痰涂片阴性肺结核患者的诊断价值分析

目的研究核糖核酸(RNA)恒温扩增实时检测技术和荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术联合应用于痰涂片阴性肺结核患者诊断中的临床价值。方法80例痰涂片阴性肺结核患者,在治疗前分别采用RNA恒温扩增实时检测技术、荧光定量PCR技术、两项技术联合方式对肺泡灌洗液标本进行检测。比较三种检测方法的阳性率、操作时间、确诊时间、住院时间、满意度。结果联合检测阳性率96.25%高于RNA恒温扩增实时检测技术的75.00%、荧光定量PCR技术的78.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术检测的阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测操作时间(42.19±8.10)min长于RNA恒温扩增实时检测技术的(28.16±5.08)min、荧光定量PCR技术的(26.73±6.95)min,确诊时间(1.68±0.35)h、住院时间(10.27±2.55)d短于RNA恒温扩增实时检测技术的(4.24±0.46)h、(19.76±2.51)d及荧光定量PCR技术的(4.69±0.72)h、(18.20±2.68)d,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术的操作时间、确诊时间、住院时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测的总满意度为96.25%,高于RNA恒温扩增实时检测技术的78.75%与荧光定量PCR技术的82.50%,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术的总满意度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论RNA恒温扩增实时检测技术和荧光定量PCR技术联合应用于痰涂片阴性肺结核诊断,可缩短确诊时间,提高患者满意度,值得临床应用。

等位基因特异扩增实时定量PCR检测新生儿高胆红素血症相关基因SLC01B1 A388G多态性

目的建立检测高胆红素血症相关基因SLC01B1 A388G多态性位点的等位基因特异扩增实时定量PCR（allele-specific real-time PCR，ASPCR）方法，用于临床样本的检测和分析。方法针对SLC01B1基因A388G多态性位点设计引物，建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品，并选取50例临床样本，其中已确诊并存在SLC01B1基因A388G突变的新生儿高胆血红素症病例30例，不存在SLC01B1基因A388G突变的健康新生儿20例，使用特异性引物和非特异性引物分别检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本，根据二者Ct（cycle threshold）值判断是否存在A388G多态性位点。评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差（△Ct）可达13．97±0．75，ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒，Probit回归分析显示其灵敏度可以达到5．28拷贝／μL。临床样本存在A388G突变的Ct值均远小于37．75，为阳性结果；不存在A388G突变的未见任何扩增或Ct值大于37．75，可判为阴性。结论ASPCR是一种快速、简便、有效的检测临床样本SLC01B1基因A388G多态性位点的方法，可用于大样本筛查新生儿高胆红素血症基因位点。

实时定量PCR技术及其应用

实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ—PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围。本文综述了RQ-PCR技术的原理、RQ-PCR仪,RQ-PCR实时定量检测系统及其应用。

实时荧光定量PCR技术在动物遗传育种中的应用

聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易污染、假阳性及定量不准确等问题也日益突出。而荧光定量PCR技术（FQ—PCR）的出现解决了以上难题，实现了从定性到定量的飞跃。此方法特异性强和可靠性更强，能实现多重反应，且采用完全闭管检测，不需要PCR后处理，有效解决PCR污染问题以及EB对试验人员的伤害；

AMSS-PCR在肺癌突变基因检测中的价值研究

背景与目的肺癌驱动基因检测具有重要意义,目前检测方法多样,临床适用性有差异。本研究旨在比较基于扩增阻碍突变系统-聚合酶链反应(Amplification Refractory Mutation System-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术的试剂盒与一代测序及ARMS-qPCR检测肺癌突变基因的敏感性和特异性,探究突变位点特异扩增法(Amplification Mutation Specific System, AMSS)-PCR技术在肺癌突变基因检测中的应用价值。方法对前期已行ARMS-PCR检测的肿瘤标本进行一代测序及试剂盒检测,比较各种方法的检测结果,并对检测结果进行统计学分析。结果本研究共收集了309例肺癌标本。试剂盒与一代测序符合率97.41%,ARMS-PCR的符合率97.73%。试剂盒与一代测序、试剂盒与实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)、qPCR与一代测序一致性检验的Kappa值分别为0.946、0.953、0.913。试剂盒以一代测序为参照的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristiccurve,ROC)曲线下面积为0.976,以qPCR为参照的ROC曲线下面积为0.975。结论 AMSSqPCR技术能够有效检测肺癌突变基因,具有较好的临床应用价值。

市售食品21种动植物过敏原成分的检测分析

为进一步明确市售食品动植物过敏原标注情况,该研究建立一种可同时检测21种动植物过敏原成分的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术,并对其进行灵敏度实验,并结合实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)检测技术对38种市售预包装食品中动植物过敏原成分进行比较分析。结果表明,采用MLPA检测技术可同时对21种动植物过敏原成分进行检测,扩增峰之间不存在交叉干扰,扩增峰实际大小和理论大小相差≤3 bp,检出最低脱氧核糖核酸(DNA)质量浓度为1 ng/μL;RT-fqPCR、MLPA技术检测标注过敏原成分食品的检出率分别为51.5%、44.1%,此外,MLPA检测法检出了6个标注可能含有过敏原成分样品中的过敏原成分,10个样品中未标记的过敏原成分。因此,采用MLPA技术检测21种动植物过敏原成分的灵敏度更高。

常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用

食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多分子生物学技术，它们因准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高等优点，越来越被广泛应用。

3种沙门氏菌RPA检测方法的建立

为了建立针对鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimu-rium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法,试验对RPA体系的反应时间和温度进行优化,并比较分析了RPA、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction,qPCR)三种检测方法的特异性及敏感性。结果表明:RPA体系的最佳反应时间为30 min,最佳反应温度为37℃。RPA、PCR、qPCR三种检测方法对检测鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌均具有良好的特异性,敏感性分别达到1×10^(1)copies/μL、1×10^(2)copies/μL和1×10^(0)copies/μL。说明建立的针对3种沙门氏菌的RPA检测方法操作简单便捷,敏感性较好。

两种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能评估研究

目的开展两种待考核试剂(RNA恒温扩增-金探针层析法、双扩增法)和参比试剂[实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time-polymerase chain reaction,qPCR)]的对比实验,评价待考核试剂的应用性能和有效性,能否满足临床检测要求。方法对2020-01-23~03-12日作者医院采集的269份样本,同时采用待考核试剂和参比试剂检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),以临床确诊/排除结果共同评价本次待考核试剂的临床试验结果。结果待考核试剂与参比试剂进行比对,灵敏度98.91%[95%置信区间(confidence interval,CI)(96.79%,100%)],特异性100%[95%CI(97.94%,100%)],总符合率99.63%[95%CI(98.90%,100%)],一致性Kappa值0.99;与临床确诊/排除结果进行比对,咽拭子、痰液、咽拭子+痰液的一致性Kappa值分别为0.90、0.92、0.92;总符合率分别为96.24%、96.39%、96.67%。结论两种SARS-CoV-2核酸检测试剂盒与参比试剂、临床确诊/排除结果比较,SARS-CoV-2检测符合情况良好,符合临床对上市产品的质量要求。

新冠病毒实验室常见检测方法

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的呼吸系统疾病,已对全球健康构成重大威胁。鉴于目前无症状感染的出现,且近期出现的Delta新冠变异株传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点,实验室高效诊断技术与方法的重要性日益突出,快速、简便、大规模的检测对控制新冠病毒的传播、患者的管理等方面起到关键作用。本文就SARS-CoV-2的相关实验室检测技术与方法进行综述,为临床医生、公共卫生与感染预防和控制提供诊断支持。