用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-PCR快速检测抗多菌灵的油菜菌核病菌

通过3对兼并性引物扩增获得与S.sclerotiorum抗药性相关的β-微管蛋白基因,全长1 685 bp,包含4个内元,相应的编码447个氨基酸。该基因与其它6种线状真菌的β-微管蛋白基因相比,氨基酸序列同源性达95.78%～97.66%,但内元数目和大小不同。比较S.sclerotiorum敏感型和抗药性菌株的β-微管蛋白基因,发现该基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸,从而导致田间抗药性的产生。为了快速、准确监测田间抗药性频率,根据S.sclerotiorumβ-微管蛋白基因的突变位点设计了2对等位基因特异性寡核苷酸(ASO),直接以菌核的基因组DNA为模板扩增,所需时间约为6 h,抗药性检出率为100%,与传统菌丝直径法的测定结果相比检测准确率为96%,而传统的检测方法至少需要1～2周。

等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变

目的:建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法:基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR(Allele specific-PCR,AS-PCR)和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果:本AS-PCR法可对JAK2基因扩增出364bp的内参照条带,当存在JAK2V617F突变时,又可以扩增出203bp的突变条带。只有野生型内参照条带364bp可被BsaXⅠ消化切割。结论:AS-PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法,可以成功应用于临床检测。

利用等位基因特异扩增快速检测水稻香味基因

水稻香味受隐性基因控制,杂合材料不表现出香味,因此在香稻选育中需要寻找一种快速、简便的香味基因检测方法。本试验通过等位基因特异扩增(ASA)方法对9个香稻和3个非香稻品种(品系),以及3个香稻/非香稻组合的F1的香味基因,进行快速检测。结果显示,纯合非香稻可获得长度为585和355bp的两条带,纯合香稻可获得长度为577和257bp的两条带,杂种F1可获得长度为355、257和580bp左右的3条带。供试材料的分子检测结果与香味基因型完全相符,所用方法快速有效,可应用于香稻育种实践。

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的:查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法:查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果:当退火温度为66℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论:多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

用等位基因特异PCR检测普通小麦(Triticum aestivum L.)的单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系(RIL)的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料,研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列,在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,对SNP进行分型,同时研究了特异引物3′端碱基错配对等位基因特异PCR的影响,优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3′端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大;在等位基因特异PCR中,Mg2+、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3′端加上合适的错配碱基,并且优化其PCR反应体系,用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。

应用等位基因特异聚核酶链式反应鉴别半夏类药材

目的建立能区分半夏正、伪品的分子鉴定方法。方法下载GenBank中半夏属、犁头尖属及天南星属相关序列,利用DNAMAN进行比对分析,根据ITS序列中半夏的SNP位点设计引物PtITS178F和PtITS555R,采用等位基因特异PCR进行扩增。结果对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测。引物PtITS178F和PtITS555R只对半夏类药材扩增395 bp片段,虎掌和水半夏均无扩增条带。结论等位基因特异PCR能准确检测半夏的SNP位点,达到准确鉴别半夏正伪品的目的,是一种有前途的中药材分子鉴定方法。

利用等位基因特异PCR鉴别虎掌南星及其部分混淆品

目的:建立中药材虎掌南星的分子鉴定方法,为天南星药材质量控制提供依据。方法:GenBank中下载半夏属、天南星属、犁头尖属物种的叶绿体rpl20基因序列,利用DNAMAN进行比对分析,发现半夏属和虎掌南星的SNP位点,并设计鉴别引物Ptrpl94F,Ptrpl708R和Pprpl148F,Pprpl484R,采用等位基因特异PCR方法对虎掌南星、半夏、水半夏3个物种的10个样品进行扩增。结果:引物Pprpl148F和Pprpl484R仅对虎掌南星扩增333 bp条带,半夏、水半夏均无扩增,能准确鉴别虎掌南星。引物Ptrpl94F和Ptrpl708R对半夏、虎掌南星均扩增611 bp条带,水半夏无扩增。结论:本实验建立的等位基因特异PCR方法能准确区别出虎掌南星和半夏、水半夏,为虎掌南星及半夏的正确用药提供了保障。

一步等位基因特异扩增法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的建立简化的一步等位基因特异扩增法(ASA),研究中国人N-乙酰化酶(NAT2)多态性等位基因的分布。方法用一步法直接检测215名中国健康人NAT2 *5,*6,*7等位基因。结果一步法测定结果与两步法一致。215名健康中国人NAT2 *5,*6,*7 3种突变型等位基因的基因频率分别为3.3％,24.6％和10.0％。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为85,96和34人,分别占39.5％,44.7％和15.8％。结论一步法测定NAT2基因准确、方便,为临床个体化合理用药提供理论基础。

等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型

目的了解人群CYP2C19基因型的分布,评价等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型。方法等位基因特异荧光PCR法和金标准Sanger DNA直接测序法检测356名供者外周血CYP2C19基因型,实验采用同步盲法。结果 CYP2C19*1/*1型、CYP2C19*1/*2型、CYP2C19*2/*3型、CYP2C19*3/*3型、CYP2C19*2/*2型及CYP2C19*1/*3型的频率分布:使用PCR荧光法检测时分别为46.6%(166/356)、33.2%(118/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、10.7%(38/356)及6.7%(24/356);采用DNA测序法时分别为46.3%(165/356)、33.4%(119/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、11.0%(39/356)及6.5%(23/356)。两种方法检测CYP2C19基因型具有一致性(P=0.392),且一致性较好(Kappa=0.987);两种方法基因型检测结果一致率为99.2%。结论为保障医疗安全,临床需开展CYP2C19基因型检测;等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型简便可靠。

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×104CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。

等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因多态性

目的了解人群乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性的分布,评价等位基因特异荧光聚合酶链反应(PCR)检测ALDH2基因应用于临床的可行性。方法采用等位基因特异荧光PCR和DNA测序法同时检测375例患者外周血ALDH2基因型,结果不一致的标本采用基因芯片技术进行复检。结果 375例标本中,荧光PCR检出ALDH2*1/1型248例(66.1%)、ALDH2*1/2型107例(28.5%)、ALDH2*2/2型20例(5.4%),而DNA测序法则分别检出246例(65.6%)、108例(28.8%)和21例(5.6%),2种方法检测ALDH2基因型差异无统计学意义(χ~2=1.33,P=0.392),且一致性较好(κ=0.978,P<0.001)。2种方法基因型检测结果一致率为98.9%(371/375)。4例结果不一致的标本经基因芯片法复检,结果与等位基因特异荧光PCR一致。结论等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因型简便、可靠,能满足临床对ALDH2基因型检测的要求。

等位基因特异PCR检测N-乙酰化转移酶遗传多态性研究

目的与方法 :改良一种适用于流行病学研究的N 乙酰化转移酶 (NAT2 )基因型的等位基因特异PCR(AS PCR)检测方法 ,分析了 3个NAT2基因突变点 :481T、5 90A、85 7A ,并用此法对 76例南京地区健康人群的NAT2基因型多态性进行了研究。从而也检验了该方法。结果 :该人群中各基因频率 :Wt(野生型 )为 0 .5 72 3:481T为 0 .0 395 ;5 90A为 0 .2 36 8;85 7A为 0 .15 13。与白种人比较差异有显著性 ,而与文献报道的亚州人群频率分布特征基本一致。结论 :南京地区健康人群中与快反应相关的NAT2基因型占多数 (82 .9% ) ;本文改良的AS PCR检测方法经验证为NAT2基因多态性研究的有效实验手段。

等位基因特异扩增法研究中国人CYP2D6中速代谢的相关基因

目的 建立CYP2D6 10B的等位基因特异扩增法 (ASA PCR) ,以探讨中国人CYP2D6中速代谢的基因分型。方法 采用两步扩增法得到CYP2D6 10B等位基因特异片段 ,分析健康中国汉族人CYP2D6 10B等位基因 ,并探讨基因分型结果与右美沙芬表型分型结果的相关性。结果 35名表型为极快代谢受试者 (VEMs)中 ,CYP2D6 10B以杂合子 (wt/m)为主占 5 7% ;2 9名中速代谢受试者 (IMs)以突变型纯合子 (m/m)为主占 6 9% ;慢代谢受试者 (PM)基因型为m/m。CYP2D6 10Bm/m组的MR明显大于wt/m组和野生型组 (wt/wt)。结论 ASA PCR法有快速、准确的优点 。

用等位基因特异扩增技术检测人类补体第八成份C8A DNA多态性的研究

建立补体第八成份蛋白质多态性的DNA检测方法。根据导致C8A多态性的DNA点突变核苷酸差异 ,建立一个检测C8A基因型的特异性扩增方法。采用该法 ,对 10 0份血样本进行检测 ,并同时用传统的检测C8A蛋白质多态性的SDS 凝胶电泳方法进行对照检测 ,结果显示新建立的C8A多态性PCR分型方法不仅快速、灵敏、稳定 ,而且分型结果清晰 ,容易判读 。

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。

等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究

了解北京地区异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌(MTB)的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值。选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR-RFLP和反向线性杂交技术(RLB)检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60.3%(35/58)存在katG315突变,13.8%(8/58)发生了inhA突变,两者同时突变率为6.9%(4/58),INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18.2%(8/44)。上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB。北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率。等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段。

平行等位基因特异序列检测技术对低比率乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测

目的评价应用平行等位基因特异性序列检测技术(parallel allele-specific sequencing,PASS),对乙型肝炎病毒(HBV)进行耐药突变位点检测效果。方法应用PASS方法对17例未经抗病毒治疗和50例经抗病毒治疗失败的乙肝患者血浆进行耐药突变检测,其中50例乙肝抗病毒治疗失败的患者血浆同时采用测序法进行耐药分析。结果 17例未接受抗病毒治疗的患者样本中有8例检测到低比率的耐药突变位点(0.04%～16.89%),9例未发现有耐药突变。50例抗病毒治疗失败患者标本有7例PASS法和测序都未检测到耐药突变,16例PASS法检测到低比率耐药突变(0.03%～5.95%),测序法未检测到任何突变位点,27例PASS法和测序法都检测到了耐药突变(36%～100%)。应用PASS法进行连锁分析表明当多个耐药突变位点以高比率在同一患者体内检测到时,它们多以连锁的关系存在于同一病毒基因组。结论 PASS方法对检测HBV感染个体中耐药病毒群具有高度的灵敏性和特异性,并能对多个耐药突变位点进行连锁性分析。

双向等位基因特异性PCR技术在杏SNP分型上的应用

【目的】建立一种基于单碱基突变的双向等位基因特异PCR(bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)技术,并将其应用于杏单核苷酸多态性分型研究。【方法】利用直接测序的方法在2份不同果肉质地杏EXP基因的DNA序列上发现1个单碱基变异。在其上、下游两端设计双向等位基因特异性引物及其外侧互补引物,对120份杏材料的SNP进行分型。同时,对部分材料的基因型进行测序验证。【结果】利用双向等位基因特异PCR对杏EXP基因315 bp处SNP分型结果与直接测序完全一致。【结论】双向等位基因特异PCR技术是一种简单、经济、快速而可靠的SNP分型方法,可有效地应用于杏基因组上已知SNP突变的分型研究。

CYP17基因多态性等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的建立快速准确检测CYP17基因单核苷酸多态性的新方法。方法用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法对53例外周血标本CYP17基因单核苷酸多态性位点rs743572进行基因分型。结果 AS-PCR测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(PCR-RFLP)的测定结果一致。结论采用AS-PCR检测CYP17基因多态性准确、快速。