基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

基于等位基因特异性PCR技术检测Sw-5b基因

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是世界范围内危害最大的病毒病之一。为了加快番茄抗TSWV育种进程,利用等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR,AS-PCR)技术建立了与TSWV抗性基因Sw-5b连锁的标记。结果表明:在63℃退火温度下,引入A-C错配的特异性引物rg3-F可以检测出抗性基因型。没有引入错配的特异性引物sg1-F,在60℃退火温度下可以检测出感病基因型。在验证试验中,利用引物Sw5b-f1/r1进行PCR扩增并测序,结果表明利用rg3-F和sg1-F进行AS-PCR,能够有效区分番茄的不同基因型。本研究建立的AS-PCR方法为育种工作者在番茄抗TSWV育种中筛选Sw-5b抗性基因提供了有力的工具。

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。

基于等位基因特异性PCR原理建立的SNP分型新方法

目的建立一种新方法,对多个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点进行分型。方法基于等位基因特异性PCR原理,采用荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术,根据PCR片段长度差异进行分型。选择SNP位点共11个,每个SNP位点设计两条长度不同、3’末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时为了增加特异性,在两条等位基因上游引物的3’末端第3或第4位碱基人为引入错配。在距离上游引物100～300bp范围内的合适位置,设计下游共用引物,并进行荧光标记。所有位点经过复合扩增后,PCR产物经ABIPrismTM310型遗传分析仪电泳分离,确定每个SNP的基因型。结果每个SNP位点纯合子为单一产物峰,杂合子则为长度不同的两个产物峰。不同的SNP位点扩增产物长度不同,根据产物长度和产物峰的数量进行SNP分型,一次完成11个SNP位点分型,其结果与直接测序完全一致。结论荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法是一种简单快速而有效的SNP分型新方法。

片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

等位基因差异特异性PCR检测HBVDNA的前C区1896突变位点及其临床意义

为了探讨ＨＢＶ前Ｃ区 １８９６突变位点检测的临床意义，采用３－末瑞等位基因差异特异性ＰＣＲ方法对９５例乙型肝炎病毒感染者的ＨＢＶＤＮＡ１ ８９６位点进行基因型（野生株／突变株）的检测，结果显示：总突变率为６４．２％，总野生率为５５．８％，纯野生型和纯突变型的检出率分别为２８．４％和２７．４％；不同临床类型的乙肝病毒感染者均可出现突变，其野生型、突变型和混合感染型的检出率之间的比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），急性乙肝与慢性乙肝、携带者、肝硬化和肝癌的总突变率存在差异（Ｐ＜０．０５）；血清不同ＨＢｅ系统均可发生突变．抗－ ＨＢｅ阳性组的突变率显著高于ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｅ系统阴性组（Ｐ＜０．０５），提示：机体感染了ＨＢＶ后．变异主要是发生在慢性持续性感染过程中．突变株逐渐替代了野生株并成为优势株．使宿主得以持续感染ＨＢＶ。

利用等位基因特异性PCR检测水稻可溶性淀粉合酶基因的单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(SNP)广泛分布于水稻基因组中,SNP分型已成为水稻遗传作图、关联分析、资源鉴定和分子标记辅助选择等研究的重要技术。本文选择水稻可溶性淀粉合酶基因SSIIIa的12个SNP位点,研究了利用等位基因特异性PCR法检测SNP的可行性。按照等位基因特异性PCR原理设计引物3'末端碱基,并根据每个SNP位点引物3'端的错配类型,在上游引物3'末端第3位引入不同的错配碱基,结果均获得了很好的扩增特异性,PCR检测结果与测序结果吻合。表明,等位基因特异性PCR是一种简便、快捷、可靠和低成本的SNP分型方法,可有效应用于水稻可溶性淀粉合酶基因的种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种等相关研究。

等位基因特异性PCR技术在5-脂氧合酶基因多态性检测中的应用

目的探讨等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶基因六个位点的单核苷酸多态性(SNP)的效果。方法采集36例哮喘患者外周静脉血2 mL,用0.2%氯化钠处理收集白细胞,采用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)法直接对已知位点的SNP进行扩增分型。针对野生型和突变型设计3'端的碱基,且倒数第二位的碱基设计故意错配的碱基,用以提高引物的特异性。结果 5-脂氧合酶六个位点的SNP检测结果准确清晰。结论采用本研究设计的引物可以对5-脂氧合酶的六个位点直接扩增分型;与测序法和限制性内切酶酶切法相比,等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶六个位点的SNP具有经济、快速、简便、易行等特点。

用等位基因特异性PCR进行β-地中海贫血产前基因诊断

目的:对两对有重型β-地中海贫血患儿家族史的夫妇进行产前基因诊断。方法:应用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)技术检测两对夫妇及其高风险胎儿的5种β-地中海贫血突变类型:CD41-42(-CTTT)缺失突变、IVSII654(C→T)突变、CD17(A→T)无义突变、TATA盒nt-28(A→G)突变和CD71-72(+A)移码突变。结果:家系1的父亲为TATA盒nt-28(A→G)/N杂合子,母亲为CD41-42(-CTTT)/N杂合子,胎儿正常;家系2的父亲为CD41-42(-CTTT)/N杂合子,母亲为CD71-72(+A)/N杂合子,胎儿为CD41-42(-CTTT)/CD71-72(+A)双重杂合子;上述2例胎儿出生及引产后的基因分析验证结果与产前基因诊断完全一致。结论:等位基因特异性PCR能准确地对β-地中海贫血高风险胎儿进行产前基因诊断,对预防重型β-地中海贫血患儿的出生具有重要意义。

等位基因特异性PCR检测CYP3A5和MDR-1基因多态性方法的建立及临床应用

目的用等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)检测细胞色素P450酶CYP3A5(A6986G)和多药耐药基因MDR-1(C3435T)基因多态性,探讨其与肾移植受者他克莫司(Tac)血药浓度和剂量比的相关性。方法根据CYP3A5(A6986G)和MDR-1(C3435T)基因多态性位点分别设计ARMS-PCR引物,分析72例肾移植受者外周血基因组DNA中该2个基因位点的多态性,同时以DNA测序法为金标准进行验证。化学发光微粒子免疫分析法测定肾移植受者血Tac浓度,并比较术后1个月时不同基因型受者之间血Tac浓度、Tac剂量/Tac用量的差异。结果建立的ARMS-PCR法与DNA测序法检测符合率为100%。72例肾移植受者中,CYP3A5*1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的发生频率分别为18.1%、31.9%和50.0%,MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的发生频率分别为27.8%、58.3%和13.9%。此外,不同CYP3A5基因型肾移植受者的血Tac浓度(P=0.014)和Tac浓度/Tac用量(P=0.019)均存在明显差异,进一步两两比较发现,CYP3A5*3/*3基因型受者血Tac浓度/Tac用量明显高于*1/*1和*1/*3基因型(P均<0.05)。结论成功建立检测CYP3A5和MDR-1基因多态性的ARMS-PCR法,肾移植受者CYP3A5*3基因多态性与Tac的药代动力学明显相关。

用等位基因特异性PCR检测β纤维蛋白原-1420G/A、-993C/T多态性的研究

目的建立分析β纤维蛋白原(Fbg)基因启动区-1420G/A、-993C/T多态性等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)的方法,并分析海南汉族人群中这两个多态性位点的基因型和等位基因频率。方法应用AS-PCR和核苷酸序列测定技术分析130例海南籍汉族人群Fbg β-1420G/A、β-993C/T多态性的基因型和等位基因频率。结果Fbg β- 1420多态性位点有GG、GA、AA等3种基因型,频率分别为0.577、0.362、0.062,G和A的等位基因频率为0.758和0.242;β-993多态性位点有CC、TT等2种基因型,频率分别为0.623、0.377,C和T的等位基因频率为0.812和0.189。结论AS-PCR为一种简便、快速、准确的检测Fbg β-1420G/A和β-993C/T多态性的方法。

等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP位点方法的建立

目的:建立等位基因特异性PCR检测脂联素基因与2型糖尿病相关SNP位点的方法。方法:针对脂联素基因G531A,G545C,G11963T,T12194G和T13320C5个SNP位点设计野生型和突变型特异性引物,第一轮PCR的上游引物或下游引物与等位基因特异性引物进行半巢式PCR。在同一SNP位点如果野生型引物出现扩增产物而突变型引物未出现扩增产物,则判定该位点为野生型,反之,为突变型;如两引物均出现扩增产物则为杂合子。DNA测序证实等位基因特异性PCR检测结果。结果:该等位基因特异性PCR检测方法对研究样本均有扩增,且每个SNP位点均检出相应的野生型、突变型和混合型个体。测序结果与等位基因特异性PCR检测结果吻合。结论:建立的等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP的方法灵敏可靠,可快速检测与2型糖尿病相关的5个SNP位点。

基于不等长引物等位特异性PCR的SNP检测方法

为开发一种便捷的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的检测方法,本研究以水稻的6种SNP变异形式(A/T, A/G, A/C, T/G, T/C, G/C)为研究对象,在下游引物为共用引物的情况下,首先设计两条长度相差20个核苷酸但3’末端分别与SNP两个等位差异碱基配对的常规上游引物。另外我们还评估在两条上游引物3’端的第2位或第3位碱基引入了错配碱基后观察对特异性的影响。结果表明,经3%的琼脂糖凝胶电泳后,不等长引物等位特异性PCR能区分不同的纯合子及杂合子,未引入错配碱基的引物只检测出A/T,C/G变异类型的SNP;而引物中引入错配碱基的等位PCR具有更高的检出效率,能检测出6种类型中的5种SNP。因此,本研究开发了一种成本低、操作简单、准确度高的SNP检测方法。

等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中的应用

目的:采用等位基因特异性PCR法对ACE基因多态性进行检测,并对脑血管疾病(CVD)与ACE基因多态性的相关性进行探讨。方法:将2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族共73例CVD患者(CVD组)和43例健康人员(对照组)进行ACE基因多态性检测,并对结果进行分析。结果:116例受检人员均获得扩增产物,CVD组患者73例扩增产物中,DD型14例(19.2%),II型30例,ID型29例;对照组43例扩增产物中,DD型5例(11.6%),II型19例,ID型19例,对照组中DD型基因频率低于CVD组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:等位基因特异性PCR检测技术可对ACE基因多态性进行有效检测,对于CVD的防治具有重要的参考意义。

基于竞争性等位基因特异性PCR技术的麦芽品种纯度定性和定量检测

利用测序技术筛选和确认4个可以区分7种大麦麦芽的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,并建立区分图谱。同时,利用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应检测技术对预混样品进行定量测试,其检测的结果与真实性之间相对误差小于3%。该技术的建立对大麦麦芽纯度检测提供方法,对大麦麦芽SNP指纹数据库的完善提供了数据支持。

等位基因特异性PCR及MLPA检测CMT患者PMP22突变基因的结果比较

目的联合应用等位基因特异性PCR与多重连接探针扩增技术(MLPA)对腓骨肌萎缩症(CMT)患者进行PMP22基因重复突变的检测,并初步验证两种方法所得结果是否一致。方法分别应用等位基因特异性PCR及MLPA技术对6例散发CMT患者及6例正常对照进行PMP22基因重复突变检测。结果 6例CMT患者及6例对照经等位基因特异性PCR均未检测出PMP22基因的特异性连接片段,且所有病例及对照经MLPA技术检测结果亦均为阴性,两种方法检测结果一致。结论利用等位基因特异性PCR和MLPA两种方法检测PMP22基因重复突变所得的结果基本一致。

双向等位基因特异性PCR技术在烟草SNP分型中的应用

为提高抗PVY烟草品种的分子育种效率,本研究针对抗病种质资源半坤村晒烟中隐性抗病基因eIF4E1的SNP位点G149C建立一种简单快速的双向等位基因特异性PCR(Bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)检测方法,并对该检测方法的特异性、准确度及实际应用效果进行验证。结果表明,建立的Bi-PASA检测方法能够在一个PCR反应中有效区分eIF4E1基因G149C位点3种基因型:野生型GG、杂合突变型GC、纯合突变型CC。利用Bi-PASA检测方法可以对K326×半坤村晒烟F2分离群体的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与普通的等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)以及直接测序法的鉴定结果一致。综上所述,本研究建立的Bi-PASA检测方法特异性强、准确度高、操作简便,可更好地应用于eIF4E1基因的分子标记辅助育种。

等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析检测膀胱癌患者尿液中TERT突变

目的建立可检测人尿液DNA中端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区域突变的方法。方法设计等位基因特异性PCR引物,利用温度梯度PCR确定等位基因特异性PCR程序,利用金磁微粒检测板进行扩增产物检测。收集34例膀胱癌患者的尿液,提取DNA,利用该文建立的等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析方法检测TERT启动子区域突变。结果建立了结合等位基因特异性PCR和金磁微粒免疫层析的TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法。34例膀胱癌患者尿液中8例患者存在C228T突变,1例患者存在C250T突变。结论该研究建立了TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法,可应用于膀胱癌患者尿液DNA突变检测。

等位基因特异性扩增法检测脊髓性肌萎缩运动神经元生存基因缺失

目的用单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态(RFLP)的方法诊断脊髓性肌萎缩(SMA)较普遍,但方法复杂。该文采用等位基因特异性扩增法进行SMA基因诊断,以探讨该方法的实用性和特异性。方法应用等位基因特异性扩增法对40名SMA患者(Ⅰ型15例,Ⅱ型17例,Ⅲ型8例)和40名正常对照进行运动神经元生存基因(SMN)基因外显子7的基因缺失研究。所有SMA患者均经RFLP方法证实缺失SMN1基因外显子7。结果等位基因特异性扩增法检测所有SMA患者均存在SMN1基因外显子7缺失,与RFLP的结果一致(诊断符合率为100%)。结论等位基因特异性扩增是既简便又实用的SMA基因诊断方法。