序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应法和DNA直接测序法检测KRAS G12D突变的对比分析

目的对比分析竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应(castPCR)法和DNA直接测序法检测肠镜活组织检查标本KRAS G12D突变的差异。方法应用活组织检查钳收集肠镜下结直肠腺瘤和结直肠癌组织,抽提组织DNA,分别采用castPCR法和DNA直接测序法获得KRAS G12D的突变情况。结果腺瘤组和腺癌组castPCR法检测的KRAS G12D突变率均显著高于同组DNA直接测序法(P值均<0.05),两组间castPCR法和DNA直接测序法检测的KRAS G12D突变率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。腺瘤组两种检测方法的突变型符合率为55.6%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为87.5%,一致性检验Kappa值为0.643 5;腺癌组两种检测方法的突变型符合率为50.0%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为85.0%,一致性检验Kappa值为0.583 3。提示两种方法检测阴性的一致性程度均较高,但检测阳性的一致性程度一般。Mutation Detector分析结果显示,castPCR法能够检测出突变量<1%的突变,灵敏度高达0.1%。检测突变量分析结果显示,当KRAS G12D突变量≥4%时,castPCR法和DNA直接测序法检测KRAS G12D均为阳性;当突变量<4%时,仅castPCR法能够检测出KRAS G12D为阳性。提示castPCR法能够检测出DNA直接测序法检测不出的KRAS G12D突变,较DNA直接测序法效率高。结论 castPCR法能够高效地检测肠镜活组织检查标本中低突变量的KRAS G12D,其临床实用价值较DNA直接测序法高。

基于定量聚合酶链式反应技术的多囊卵巢综合征与促卵泡激素的受体基因多态性的相关性研究

目的多囊卵巢是造成不孕和子宫内膜癌等疾病的重要因素之一,该研究目的是探索多囊卵巢与相关单核苷酸的多态性位点相关性。方法该研究首先提出了一种改良的等位特异的定量聚合酶链式反应技术并对其进行了可靠性评估,随后对多囊卵巢患者和对照样本进行了卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点进行了分型鉴定。结果该研究结果显示其提出的改良的定量聚合酶链式反应方法进行单核苷酸的多态性位点分型准确度高,区分度好,与Sanger测序法获得的结果完全一致,能够很好的用于单核苷酸的多态性等多态性位点的分型鉴定;该实验对152例多囊卵巢患者和152例对照样本中卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点分型检测结果显示Thr307Ala和Asn680Ser两个位点的等位基因频率和基因型频率均呈现了与多囊卵巢之间的显著相关性。结论该研究结果表明卵泡刺激素受体基因的两个单核苷酸的多态性位点可能与多囊卵巢的发病密切相关,为深入探讨该疾病和进一步研究单核苷酸的多态性分型奠定了基础。

聚合酶链式反应技术快速检测化妆品中大肠杆菌的研究

利用聚合酶链式反应(PCR)技术建立了一种快速检测化妆品中大肠杆菌的方法。根据大肠杆菌的ITS保守序列设计特异性引物,确定引物的特异性;比较3种不同提取大肠杆菌DNA的方法,确定煮沸法为最优方法;模拟染菌的化妆品样品,对其进行增菌,并作为模板进行PCR扩增。结果表明,此方法可以在原样品活菌浓度约8×100 cfu/mL时通过12 h增菌后检测出来,总的检测时间可以控制在24 h内。

聚合酶链式反应技术快速检测化妆品中大肠杆菌的研究

利用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术建立了一种快速检测化妆品中大肠杆菌的方法。根据大肠杆菌的ITS保守序列设计特异性引物，确定引物的特异性；比较3种不同提取大肠杆菌DNA的方法，确定煮沸法为最优方法；模拟染菌的化妆品样品，对其进行增菌，并作为模板进行PCR扩增。结果表明，此方法可以在原样品活菌浓度约8×10^0cfu／mL时通过12h增菌后检测出来，总的检测时间可以控制在24h内。

应用于组织病理学中的聚合酶链式反应技术

应用于组织病理学中的聚合酶链式反应技术蔡豪斌（广西桂林医学院生物工程研究所桂林市５４１００１）由于聚合酶链式反应基因扩增技术的出现，对组织标本的分子遗传学研究变得相对直观。组织病理学家开始对大量保存的组织病理学标本进行分子水平的分析研究。本文将对应用...

实时荧光定量聚合酶链式反应用于儿童肺炎支原体检验中的临床效果分析

目的探讨实时荧光定量聚合酶链式反应在儿童肺炎支原体检验中的应用效果。方法选择2017年9月-2019年12月我院收治的疑似肺炎支原体感染患儿120例。采用实时荧光定量聚合酶链式反应与快速培养法对患儿咽试子进行肺炎支原体检测分析。对比两种检测方法的敏感度、特异度及诊断符合率。结果实时荧光定量聚合酶链式反应对儿童肺炎支原体肺炎诊断的敏感度略高于快速培养法,差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量聚合酶链式反应对儿童肺炎支原体肺炎诊断的特异度、符合率分别为为91.84%、88.33%,高于快速培养组的77.56%、76.66%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论实时荧光定量聚合酶链式反应能够早期检出儿童肺炎支原体,具有较高的特异度与符合率,值得广泛推广。

等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因多态性

目的了解人群乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性的分布,评价等位基因特异荧光聚合酶链反应(PCR)检测ALDH2基因应用于临床的可行性。方法采用等位基因特异荧光PCR和DNA测序法同时检测375例患者外周血ALDH2基因型,结果不一致的标本采用基因芯片技术进行复检。结果 375例标本中,荧光PCR检出ALDH2*1/1型248例(66.1%)、ALDH2*1/2型107例(28.5%)、ALDH2*2/2型20例(5.4%),而DNA测序法则分别检出246例(65.6%)、108例(28.8%)和21例(5.6%),2种方法检测ALDH2基因型差异无统计学意义(χ~2=1.33,P=0.392),且一致性较好(κ=0.978,P<0.001)。2种方法基因型检测结果一致率为98.9%(371/375)。4例结果不一致的标本经基因芯片法复检,结果与等位基因特异荧光PCR一致。结论等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因型简便、可靠,能满足临床对ALDH2基因型检测的要求。

等位基因特异PCR技术检测结核分支杆菌rpoB基因突变研究

目的 建立并评价等位特异多聚酶链反应检测结核分支杆菌耐利福平基因rpoB突变的方法。方法 设计与rpoB基因突变后的碱基配对的引物用于扩增突变基因,建立AS-PCR检测rpoB基因突变的方法,并对58株结核菌进行了检测。结果AS-PCR检测结核菌耐利福平相关基因rpoB的敏感性为77.3％,特异性达91.7％。AS-PCR检测rpoB基因,有1628A→T、1657C→T,G和1673C→T突变分别占耐利福平结核菌株的18.2％,22.7％和36.4％。检测rpoB突变与MIC测定RFP耐药率和PCR-SSCP检测的总符合率分别为86.2％和74.1％。检测试验可在3～4h内完成。结论 AS-PCR方法是检测结核菌耐利福平基因突变的敏感和快速方法,可在临床实验室使用并为临床医师提供治疗依据。

等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性

目的:应用等位特异PCR法检测IL-6启动子区-634位C/G变异,以探讨ASPCR应用的可行性.方法:应用ASPCR法和PCR-RFLP法同时检测101例研究对象IL-6启动子区-634位C/G变异的多态性,并对二者的结果进行比较研究.结果:(1)除一个CC基因型结果不一致外,其余的CG、GG和CC基因型两种方法的结果都一样;(2)ASPCR在单点突变多态性的检测中,具有省时、快速和成本低等优点.结论:APCR方法检测基因的已知突变,具有快速、准确、省时、价格低等优点,在满足引物模板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下,可优先选用此法.

中国梨2个自交不亲和新等位基因(S等位基因)的分子鉴定(英文)

自交不亲和是显花植物的一种重要生殖生理现象,为探明中国梨的自交不亲和特性,对‘锦香’(Pyrus bretschneideri cv. Jinxiang)和‘鹅酥’(Pyrus bretschneideri cv. Esu)2个中国梨品种进行了基因组PCR特异扩增、S基因序列分析及田间杂交授粉试验。结果确定它们各含1个新S-RNA酶基因,分别命名为S37-和S38-RNase,GenBank序列号为DQ839238和DQ839239。生物信息学分析结果表明,S37-和S38-RNA酶的推导氨基酸序列与S1-至S36-RNA酶36个梨S基因具有相同的、高度保守的C1和C2区,但其高变区与S1-至S36-RNA酶差异较大,其中与S15的差异最小,只有3个氨基酸不同。在推导的氨基酸水平上,S37与S38有96%的序列相似性,但两者与S15的相似性更高,皆为98%,与S32的相似性最低,都只有63%;S37和S38的内含子较大,分别为786bp和723bp,与S15的777bp大小接近。最后,经分析验证确定‘锦香’和‘鹅酥’的S基因型分别为S34S37和S15S38。

胸椎黄韧带骨化与HLA-DQA1等位基因的相关性研究

目的 :分析黄韧带骨化与HLA -DQA1等位基因的相关性。方法 :用聚合酶链式反应 /序列特异引物 (PCR-SSP)法对 3 0例OLF患者、5 1例正常对照进行HLA -DQA1等位基因的基因的分型。结果 :HLA -DQA1 0 40 1同OLF呈显著正相关 (GF =2 0 .0 % ,RR =7.3 2 7,P <0 .0 1) ,DQA1 0 2 0 1与OLF呈显著性负相关 (GF =5 .0 % ,RR =0 .2 0 1,P <0 .0 1) ;且DQA1 0 40 1的病因分数 >DQA1 0 2 0 1的预防分数 (EF/PF =0 .173 /0 .162 )。结论 :HLA -DQA1 0 40 1可能与OLF的疾病易感性相关 ,HLA -DQA1 0 2 0 1可能与OLF的抗性相关 ,在HLA -DQA1位点存在易感和抵抗双重作用 ,等位基因之间的共同作用可能是影响OLF发病的重要因素之一。

中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程相关性研究

目的：通过对中国人群HIV-1感染典型进展者（Typical progressors，TP）和长期不进展者（Long-term nonpmgressors，LTNP）HLA-B等位基因的分布频率的研究，探讨中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程的关系。方法：采用整群随机抽样方法从河南、吉林、辽宁、新疆、云南五省收集356例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者血样，其中289例典型进展者和67例长期不进展者。应用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）对其HLA-B等位基因特异性进行检测，并分析了他们的等位基因纯合子情况及Bw4／Bw6血清型，比较二组差异。结果：发现4个HLA-B等位基因位点在中国HIV-1感染人群中的表达频率较高，分别是HLA-B^＊13（TP：11．8％；LTNP：15．7％）、HLA-B^＊15（TP：17．3％；LTNP：8．2％）、HLA-B^＊40（TP：12．5％；LTNP：17．9％）、HIA-B^＊51（TP：9％；LTNP：10．4％）。其中长期不进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为4．5％，典型进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为1．2％，前者明显高于后者，具有显著性差异（P=0．022，OR=0．26，95％CI=0．08-0．89）。典型进展组的B^＊15的等位基因频率（17．3％）显著高于长期不进展组（8．2％）（P=0．009，OR=2．34，95％CI=1．18～4．76）。结论：HLA-B^＊67等位基因可能与延缓中国HIV-1感染者疾病进程相关，HLA-B^＊15等位基因可能与加速中国HIV-1感染者疾病进程相关。

绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验。在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠。结果表明,交联度49∶1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1∶4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法。

中国人群人类白细胞抗原A、B和DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的鉴别

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当某些等位基因间的差异碱基位于测序范围外时,无法得到清晰的等位基因结果。目的:分析中国人群人类白细胞抗原A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的分布规律,探讨其在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型中的解决方案。设计、时间及地点:采用随机抽样方法对研究样本进行人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型,并对其中的模棱两可等位基因进行验证性实验,于2006-01/2008-06在深圳市血液中心完成。材料:658名深圳骨髓库汉族供者乙二胺四乙酸盐抗凝血5mL。方法:采用聚合酶链式反应--测序分型方法对658名深圳骨髓库供者的人类白细胞抗原A、B和DRB1基因进行高分辨分型,并采用针对相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物方法对其中由于碱基差异位于检测区外而产生的模棱两可等位基因进行鉴别。主要观察指标:模棱两可等位基因的分布及确认。结果:658份标本中,人类白细胞抗原A、B和DRB1三个基因座的模棱两可等位基因分别为9个(2种)、140个(5种)、406个(8种),占等位基因总数的14.06%(555/3948)。高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物鉴定结果显示,中国报道的DRB1*1401被全部确认为DRB1*1454;12例B*0705/B*0706中,有1例被确认为B*0706,其他13种等位基因的鉴定结果分别为A*6801、A*7402、B*2705、B*3501、B*4402、B*5801、DRB1*0101、DRB1*0406、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1201、DRB1*1302和DRB1*1502。结论:在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原基因的测序分型中可以应用直接鉴别的方法区分模棱两可等位基因,但在临床移植前的高分辨确认试验中则需要采用实验方法进行精确分型。

垂体特异转录因子pit-1在垂体瘤中的表达及意义的实验研究

目的检测垂体特异转录因子pit-1在垂体腺瘤中的表达,研究Pit-1与激素水平、肿瘤侵袭性的关系,以探讨Pit-1在垂体瘤发病机制中的作用。方法根据术前激素水平、临床表现及术后病理诊断确定腺瘤类型,依影像学表现、术中所见及硬膜病检结果判断对肿瘤侵袭性分级,用免疫组化和RT-PCR分别测定Pit-1蛋白和pit-1mRNA的表达。结果Pit-1在GH腺瘤、PRL腺瘤、GH/PRL混合腺瘤中均有表达,与对照组相比,中、高度表达者占此3种腺瘤的78.8%(26/33),无功能腺瘤及ACTH腺瘤中无Pit-1蛋白的表达。pit-1mRNA在全部的GH腺瘤、PRL腺瘤、GH/PRL混合腺瘤和50%(5/10)的无功能腺瘤中有表达,在ACTH腺瘤组中无表达。GH、PRL、GH/PRL混合腺瘤组间pit-1mRNA的表达量差异无显著性,此3组均显著高于无功能腺瘤组(P<0.05)。GH、PRL腺瘤组中pit-1mRNA的表达量与其各自术前的激素水平呈显著正相关。在表达pit-1mRNA的腺瘤中,侵袭性组高于非侵袭性组。结论Pit-1的表达与垂体腺瘤的表型、功能有关,与某些激素(GH、PRL)水平、肿瘤的侵袭性呈正相关,在某些类型(GH、PRL、GH/PRL)的垂体瘤发病机制中起重要作用。

中国人前列腺特异膜抗原基因真核表达载体的构建和序列测定

目的 :构建中国人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列的真核表达载体并进行序列测定。方法 :从前列腺癌组织中提取总RNA ,采用RT -PCR技术扩增前列腺特异膜抗原的基因编码区序列 ,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3 0 ,并进行序列测定。结果 :本实验所扩增的中国人PSMA基因编码区序列与Israeli等报道的序列同源性为 99 7% ,目的基因与载体正确连接。结论 :成功克隆了PSMA编码区序列 ,并构建了其真核表达载体 ,为PSMA基因修饰的树突状细胞疫苗的前列腺癌生物治疗奠定基础。

中国北方汉族泛发型白癜风与HLA-DRB1等位基因的相关性

目的:探讨HLA-DRB1等位基因与中国北方汉族泛发型白癜风的相关性。方法:采用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术检测34例北方汉族泛发型白癜风患者的HLA-DRB1等位基因。结果:与262例正常对照组相比较,泛发型白癜风患者HLA-DRB1*0701/02、DRB1*1201/02基因频率显著增高(Pc<0.0001),HLA-DRB1*0901、DRB1*11基因频率降低(但经校正后Pc>0.05);有明确家族史的患者HLA-DRB1*1201/02基因频率显著增高(Pc<0.0001);无家族史者HLA-DRB1*0701/02基因频率显著升高(Pc<0.0001),DRB1*1201/02基因频率显著增高(经校正后Pc>0.05),DRB1*0901基因频率降低(经校正后Pc>0.05)。结论:中国北方汉族人群,HLA-DRB1*0701/02、DRB1*1201/02等位基因可能与泛发型白癜风的发病有关,而DRB1*0901、DRB1*11等位基因可能是防止其发病的“保护因子”,为进一步揭示泛发型白癜风的易感基因及免疫遗传发病机制提供线索。

广西地区壮、汉族系统性红斑狼疮与HLA-DRB1等位基因相关性研究

目的:探讨广西地区壮、汉族系统性红斑狼疮(SLE)与HLA-DRB1等位基因的相关性。方法:用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,分别对52例SLE壮族患者和70名壮族健康人,45例SLE汉族患者和60名汉族健康人的HLA-DRB1等位基因进行研究。结果:壮族SLE患者HLA-DRB11401及DRB116两个等位基因的频率低于正常对照组(RR=0.2813,χ2=5.0024,P=0.0252及RR=0.3889,χ2=3.9527,P=0.0466),患者组和对照组均未检出HLA-DRB108、DRB111和DRB113等位基因;汉族SLE患者HLA-DRB115等位基因的频率高于正常对照组(RR=2.5333,χ2=8.4006,P=0.0037),患者组未检出HLA-DRB111、DRB113等位基因,对照组亦未检出HLA-DRB113等位基因。结论:提示HLA-DRB11401及DRB116等位基因可能是广西地区壮族人SLE的保护基因,未发现易感基因。提示HLA-DRB115等位基因可能是广西地区汉族人SLE的易感基因。

广西籍汉族SLE患者与HLA-DQA1等位基因的相关性研究

目的探讨广西籍汉族系统性红斑狼疮(SLE)及狼疮性肾炎(LN)患者与人类白细胞抗原-DQA1(HLA-DQA1)等位基因的相关性。方法用聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)对64例广西籍汉族SLE患者及60例汉族健康人群的HLA-DQA1频率进行检测和相关分析。结果在广西籍汉族人群中检出HLA-DQA1*0101、0102、0103、0104、0201、0301、0302、0401、0501、0601共10个亚型;SLE组HLA-DQA1*0101、0102等位基因频率较正常对照组显著升高(χ2=8.627,P=0.003,RR=3.421及χ2=8.965,P=0.003,RR=3.314);LN组HLA-DQA1*0102等位基因频率较无LN表现的SLE组显著升高(χ2=6.418,P=0.011,RR=4.688);LN组HLA-DQA1*0501等位基因频率较无LN表现的SLE组显著降低(χ2=6.130,P=0.013,RR=0.172);未发现与LN病理类型显著相关的HLA-DQA1等位基因。结论DQA1*0101、0102可能是广西汉族SLE的易感基因;DQA1*0102可能是广西汉族LN的易感基因,HLA-DQA1*0501可能是广西汉族LN的保护基因。