竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应法和DNA直接测序法检测KRAS G12D突变的对比分析

目的对比分析竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应(castPCR)法和DNA直接测序法检测肠镜活组织检查标本KRAS G12D突变的差异。方法应用活组织检查钳收集肠镜下结直肠腺瘤和结直肠癌组织,抽提组织DNA,分别采用castPCR法和DNA直接测序法获得KRAS G12D的突变情况。结果腺瘤组和腺癌组castPCR法检测的KRAS G12D突变率均显著高于同组DNA直接测序法(P值均<0.05),两组间castPCR法和DNA直接测序法检测的KRAS G12D突变率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。腺瘤组两种检测方法的突变型符合率为55.6%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为87.5%,一致性检验Kappa值为0.643 5;腺癌组两种检测方法的突变型符合率为50.0%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为85.0%,一致性检验Kappa值为0.583 3。提示两种方法检测阴性的一致性程度均较高,但检测阳性的一致性程度一般。Mutation Detector分析结果显示,castPCR法能够检测出突变量<1%的突变,灵敏度高达0.1%。检测突变量分析结果显示,当KRAS G12D突变量≥4%时,castPCR法和DNA直接测序法检测KRAS G12D均为阳性;当突变量<4%时,仅castPCR法能够检测出KRAS G12D为阳性。提示castPCR法能够检测出DNA直接测序法检测不出的KRAS G12D突变,较DNA直接测序法效率高。结论 castPCR法能够高效地检测肠镜活组织检查标本中低突变量的KRAS G12D,其临床实用价值较DNA直接测序法高。

等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价

载脂蛋白E（apolipoproteinE、apoE）是血浆主要载脂蛋白之一，具有明显的遗传多态性，3种常见的等位基因（ε2、ε3、ε4）分别编码3种主要异构体（E2、E3、E4），产生6种不同的基因型（ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4）。apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素，而且与Alzheimer病密切相关。

等位基因特异性聚合酶链反应检验多药耐药基因的多态性

目的:建立分析MDR1基因-3435C/T多态性等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)的方法,并分析中国汉族人群中这个位点的基因型和等位基因频率。方法:对202例中国汉族健康男性采用等位基因特异聚合酶链反应和核苷酸序列测定技术分析其MDR1基因-3435C/T多态性的基因型和等位基因频率。结果:MDR1基因-3435多态性位点有CC、CT、TT3种基因型,频率分别为32.2%,54.4%,13.4%。C和T等位基因频率为59.4%和40.6%。结论:等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)简便、准确、快速,适合于MDR1-C/T基因多态性检测。

等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因多态性

目的了解人群乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性的分布,评价等位基因特异荧光聚合酶链反应(PCR)检测ALDH2基因应用于临床的可行性。方法采用等位基因特异荧光PCR和DNA测序法同时检测375例患者外周血ALDH2基因型,结果不一致的标本采用基因芯片技术进行复检。结果 375例标本中,荧光PCR检出ALDH2*1/1型248例(66.1%)、ALDH2*1/2型107例(28.5%)、ALDH2*2/2型20例(5.4%),而DNA测序法则分别检出246例(65.6%)、108例(28.8%)和21例(5.6%),2种方法检测ALDH2基因型差异无统计学意义(χ~2=1.33,P=0.392),且一致性较好(κ=0.978,P<0.001)。2种方法基因型检测结果一致率为98.9%(371/375)。4例结果不一致的标本经基因芯片法复检,结果与等位基因特异荧光PCR一致。结论等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因型简便、可靠,能满足临床对ALDH2基因型检测的要求。

等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价

目的建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用。方法等位基因特异性PCR方法。结果等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3′端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系。高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性。结论等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法。

等位基因特异性多重PCR快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的初步研究

目的建立等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele-specific PCR,MAS-PCR)技术,以快速检测结核分枝杆菌对喹诺酮的耐药性。方法根据结核分枝杆菌gyrA基因序列,分别设计4条特异性寡聚核苷酸引物,优化PCR条件,建立针对gyrA基因90和94位点突变进行检测的MAS-PCR技术,对临床分离菌株进行喹诺酮耐药性检测,同时以比例法和DNA直接测序法做对照。结果共对144株喹诺酮敏感株和56株喹诺酮耐药株进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法比较,敏感性为53.57%(30/56);与DNA测序比较,敏感性为71.43%(30/42),特异性均为100%(144/144)。结论 MAS-PCR技术检测结核分枝杆菌对喹诺酮耐药性简便、快速、特异性高,但敏感性需进一步提高。

等位基因特异PCR技术检测结核分支杆菌rpoB基因突变研究

目的 建立并评价等位特异多聚酶链反应检测结核分支杆菌耐利福平基因rpoB突变的方法。方法 设计与rpoB基因突变后的碱基配对的引物用于扩增突变基因,建立AS-PCR检测rpoB基因突变的方法,并对58株结核菌进行了检测。结果AS-PCR检测结核菌耐利福平相关基因rpoB的敏感性为77.3％,特异性达91.7％。AS-PCR检测rpoB基因,有1628A→T、1657C→T,G和1673C→T突变分别占耐利福平结核菌株的18.2％,22.7％和36.4％。检测rpoB突变与MIC测定RFP耐药率和PCR-SSCP检测的总符合率分别为86.2％和74.1％。检测试验可在3～4h内完成。结论 AS-PCR方法是检测结核菌耐利福平基因突变的敏感和快速方法,可在临床实验室使用并为临床医师提供治疗依据。

海南文昌汉族人群中两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的研究

目的:分析海南文昌人群中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因1376G→T、95A→G突变。方法:应用硝基四氮唑蓝定量法进行G6PD缺乏症的筛查,用等位基因特异PCR检测1376G→T、95A→G突变。结果:在358位海南文昌汉族人中,发现G6PD缺乏症患者20例,其中9例患者有1376G→T突变,3例患者有95A→G突变。结论:1376G→T、95A→G突变是文昌人群中常见的突变。

支气管哮喘患者ADAM33基因S2位点多态性的研究

目的检测ADAM33基因S2位点多态性在支气管哮喘患者中的分布频率，探讨S2位点单核苷酸多态性与支气管哮喘的相关性。方法采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS—PCR）技术及DNA测序的方法，对126例哮喘患者及121例健康人进行ADAM33基因S2位点单核苷酸多态性分析。结果ADAM33基因S2位点在哮喘组和对照组中基因型分布均符合Hardy—Weinburg平衡定律；ADAM33基因S2位点3种基因型（CC、CG、GG）在哮喘组分布为64例（50．8％）、45例（35．7％）、17例（13．5％），在对照组分布为72例（59．5％）、44例（36．4％）、5例（4．1％），两组比较有统计学差异（x^2=6．929，P〈0．05）。哮喘组与对照组C及G等位基因频率比较差异有显著性（x^2=5．122，P〈0．05）。结论ADAM33基因S2位点在支气管哮喘人群中存在CC、CG、GG多态性；ADAM33基因S2位点多态性与支气管哮喘有明显相关性。

JAK2 V617F基因突变与脑梗死的相关性

脑梗死占急性脑梗死的20%~30%〔1,2〕。JAK2 V617F基因突变为体细胞获得性单核苷酸突变,是由JAK2基因1 849位鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T),使JAK2蛋白617位缬氨酸错义编码为苯丙氨酸,导致JH2区的空间结构发生变化,使其对JH1区的抑制作用消失、JAK2激酶的活性增加〔3〕。JAK2V617F基因突变可出现在非典型慢性粒细胞性白血病。

海南汉、黎族人群中ABO基因的DNA多态性

目的研究海南汉、黎族人群中ABO基因DNA多态性及其基因频率分布的特点。方法应用等位基因特异性聚合酶链反应检测了255例海南汉族人样本DNA和379例海南黎族人样本DNA的ABO血型基因型,根据遗传距离和聚类分析比较海南汉、黎族的ABO血型基因频率与其他群体的差异,确定其在中国地理分布上的位置。结果用等位基因特异性聚合酶链反应技术可鉴定出6种ABO血型基因型AA、AB、AO^1、BB、BO^1、O^1O^1,其鉴定的ABO基因分型结果与DNA测序结果完全符合;在海南汉族人群中O^1O^1、BO^1、AO^1、AB、AA、BB基因型的频率分别为34.90%、23.53%、22.75%、6.27%、6.27%和6.27%,A、B、O^1等位基因频率分别为20.78%、21.18%和58.04%;在海南黎族人群中O^1O^1、BO^1、AO^1、AB、AA、BB基因型的频率分别为30.87%、26.39%、16.09%、13.19%、6.86%和6.60%, A、B、O^1等位基因频率分别为21.50%、26.39%和52.11%。根据遗传距离和聚类分析,海南汉族ABO血型分布介于北方和西北各省组与长江流域和西南区组之间,而海南黎族ABO血型分布与我国各省区的ABO血型分布4个组的聚类现象不明显。结论海南汉、黎族人群ABO血型基因频率分布存在明显的种族和地域的遗传多态性。

一种简化的检测SMN1基因纯合性缺失的方法

目的建立一种更加准确、快捷的方法,简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症。方法应用双侧等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)进行SMN1基因的特异扩增,并用另1个无关基因作内对照,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析,确定患儿是否为纯合缺失型脊髓性肌萎缩症。结果双重AS-PCR产物,通过PAGE或琼脂糖凝胶电泳,可准确判读患儿是否存在SMN1基因外显子7纯合性缺失。结论相对于以往常规使用的PCR-酶切或变性高效液相层析(DHPLC)方法,本研究所建立的方法不需要复杂的后续分析手段,能够更准确、快捷、简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症患儿。

结核杆菌利福平耐药与rpoB基因突变的相关性研究

目的:分析西安地区耐利福平(RIF)结核杆菌临床分离株rpoB基因突变的特点,探讨快速检测结核杆菌耐RIF基因型的方法.方法:对120株西安地区收集的结核杆菌临床分离株(药敏结果为耐RIF81株,对RIF敏感39株),分别采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和等位基因特异性多重聚合酶链反应(MAS-PCR)检测rpoB基因突变情况.结果:PCR-SSCP检测,耐RIF菌株中rpoB基因突变发生率为85%(69/81),39株敏感株中仅有1株发生突变,突变率为2%(1/39).MAS-PCR检测,耐RIF菌株中rpoB基因突变发生率为93%(75/81),39株敏感株中未发现rpoB基因突变;531,516和526位点突变的比例分别为45%(34/75),24%(18/75)和20%(15/75).结论:西安地区结核杆菌临床分离株耐RIF与rpoB基因突变相关,MAS-PCR检测rpoB基因可作为临床耐RIF结核杆菌的简单快速准确的早期诊断方法.

ADAM33基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联研究

目的研究解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联性。方法选取2019年12月至2020年12月在该院就诊并接受治疗的支气管哮喘患者120例作为研究组,选择同期在该院体检的健康者120例作为对照组,采用等位基因特异性聚合酶链反应技术及DNA测序方法检测两组ADAM33基因T2位点多态性。结果研究组和对照组ADAM33基因T2位点3种基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。研究组与对照组ADAM33基因T2位点基因型(AA、AG、GG)频率比较,差异均有统计学意义(χ^(2)=7.001,P<0.05)。ADAM33基因T2位点等位基因中,研究组A等位基因频率(15.42%)低于对照组(23.75%),差异有统计学意义(P<0.05)。ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘患病风险(OR=0.875,P<0.05)。与中度支气管哮喘患者相比,危重、重度支气管哮喘患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率差异无统计学意义(P>0.05),中度、重度、危重支气管哮喘患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率高于轻度支气管哮喘患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素(P<0.05)。结论支气管哮喘与ADAM33基因位点多态性存在关联:ADAM33基因T2位点与支气管哮喘易感性有关,ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘的患病风险,ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素。

JAK2V617F点突变在原发性血小板增多症中的初步研究

原发性血小板增多症（essential thrombocythemia．ET）是骨髓增殖性疾病（MPD）的一种，是多能干细胞慢性克隆增生性疾病，主要临床表现为外周血血小板计数持续显著升高。近来国外学者发现ET患者普遍存在JAK2（Januskinese2）基因12号外显子第1849位核苷酸G—T突变，使得负调控功能区JAK2蛋白的617位缬氨酸错义编码为苯丙氨酸。我们采用等位基因特异性聚合酶链反应（PCR）的方法对32例ET患者进行JAK2V617F的检测，报告如下。

乙肝病毒C基因启动子基因变异的检测及临床意义

目的建立等位 PCR 检测 HBV C 基因启动子(BCP)基因碱基变异的方法,并探讨检测其基因突变对于乙肝病人临床治疗的意义。方法在 3' 端设计和合成与野生和突变碱基互补的引物,建立等位 PCR 检测碱基变异的方法,并通过核苷酸序列测定进行对比来检测慢性和急性乙肝病例、肝癌病例的血清样本。结果经统计学处理该检测方法与核苷酸序列测定所得的结果,得到χ2=0.004, P>0.05,差异不显著。急性和慢性乙肝病例、肝癌病例的临床血清样本的检测结果为 BCP 基因碱基变异比例分别为3.9%、26.7%、41.2%,其中 1762 位及 1764 位双突变型血清样本在肝癌病例中的比例比慢性乙肝病例高,且有统计学意义。结论该等位 PCR 检测 HBV C 基因启动子变异的方法适用于临床血清样本检测,结果可靠且简便易行。BCP 基因 1762 位及 1764 位突变的检测结果说明这两个突变与乙肝以及其后期发展为肝癌正相关。通过检测这两个突变可预测病情发展 , 对指导临床治疗有显著的意义。

湖北地区汉族人群TNF-β804C/A多态性研究

目的 了解中国湖北地区汉族人群肿瘤坏死因子 - β(TNF - β)基因第三外显子 80 4位点单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism ,SNP)分布 ,并与其它种族进行比较。方法 收集湖北地区 2 5 7名无血缘关系健康个体的静脉血 ,提取DNA ,应用套式PCR(nestedPCR)和等位基因特异性PCR(allele-specificPCR ,AS -PCR) ,对TNF - β基因 80 4C/A多态性进行分析 ,并与其它种族的分布进行比较。结果 TNF - β检测到 3种基因型 ,基因型频率分别为CC型 37 2 % ,CA型4 5 6 % ,AA型 17 2 % ,基因型分布符合Hardy-Weinberg定律。统计分析显示湖北地区汉族人群TNF - β基因型分布与欧洲白种人及日本人有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,等位基因频率与欧洲白种人有显著性差异 (P <0 .0 5 )而与日本人则无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 湖北地区汉族人群中存在TNF - β基因多态性 ,其突变率较高 ,与其它种族比较分布有明显的差异 ,这种差异可能是导致一些疾病在不同种族间的表现有所不同的遗传因素之一。

凝血相关基因多态性与下肢深静脉血栓形成的相关性

目的探讨rs1799963(凝血因子V基因Leiden)、rs6025(凝血酶原基因G20210A)、rs1042579(血栓调节蛋白基因c.1418C>T)及rs1801131(亚甲基四氢叶酸还原酶基因)4个凝血相关基因的多态性与下肢深静脉血栓形成的相关性。方法采用竞争性等位基因特异性聚合酶链反应(kompetitive allele specific polymerase chain reaction,KASP)技术检测150例下肢深静脉血栓患者及153例健康对照者上述4个基因分型,采集相关血液生物化学指标,建立二元Logistic回归筛选下肢深静脉血栓形成的独立危险因素,校正混杂因素后在不同遗传模式下分析下肢深静脉血栓与各指标及4种凝血相关基因多态性的相关性。结果D-二聚体、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、性别、年龄这5个变量可能是下肢深静脉血栓形成的危险因素。将这些变量引入4种基因遗传模式,在二元Logistic回归环境下进行校正,结果显示,rs1042579突变在显性遗传模式下与下肢深静脉血栓形成具有相关性。结论rs1799963、rs6025、rs1801131的基因多态性与下肢深静脉血栓形成无明显相关性,rs1042579的基因多态性在显性遗传模式下发挥作用,可能是下肢深静脉血栓形成的独立危险因素。

新疆四个苯丙酮尿症家系的基因诊断

目的 :研究新疆苯丙酮尿症 (PKU )家系苯丙氨酸羟化酶 (PAH)基因突变位点及其遗传标记 ,探索适合新疆各民族 PKU基因诊断和产前基因诊断途径。方法 :联合采用 PCR- STR、ASPCR和 PCR- SSCP 3种基因诊断方法进行分析。结果 :(1) PCR- STR连锁分析表明 :除家系 4母亲为 STR纯合型外 ,其余家系双亲皆为杂合子。对家系 1(维吾尔族 ) 1例风险胎儿 (妊娠 6周 ,流产 )进行产前基因诊断和 1例新生儿 (出生 1d)进行症前基因诊断 ,均为携带者 ,并经出生后证实。 (2 )采用 ASPCR法在家系 1、2和 3均未检出 R2 43Q和 R413P两种常见突变。 (3)应用 PCR- SSCP分析发现 ,家系 2 (回族 )患儿为外显子 7突变纯合子 ,家系 4(汉族 )患儿为外显子 7和外显子 11突变复合体 ,其外显子 11突变位于第 399位点 (GTA→ GTT) ,可能为一致病突变。 结论 :上述 3种基因诊断方法联合使用简便、快捷 ,适合新疆地区的基因诊断和产前基因诊断。