非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

针对非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立进行研究,为了形成一种快速、操作性强的分子检测技术手段,生物研究领域提出基于ASFA重组酶聚合酶扩增的等温检测方法。当非洲猪瘟病毒在38℃水浴锅中反应30 min,能实现目的片段的扩增,便于之后的病毒检测。该方法具有检测成本低、操作简单、结果可靠等优势,为非洲猪瘟有效防范提供了有效的技术保障。

鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是鲑鱼胰脏病(Salmon pancreas disease,PD)病原,主要感染鲑科鱼类,目前在我国尚未分离到。为提高出入境鱼类中的SAV检测效率,根据SAV nsP1基因片段,设计3对特异性引物,建立了检测SAV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间为1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,且不与传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病病毒、草鱼呼肠孤病毒和鲤春病毒血症病毒的RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见。本研究建立的RTLAMP方法是一种特异性强、方便快捷的SAV检测方法,适合SAV的现场初筛和核酸检测。

草鱼呼肠孤病毒873株逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。

肺炎克雷伯氏菌新型等温扩增检测方法的建立

采用交叉引物等温扩增方法对食品中肺炎克雷伯氏菌建立快速检测方法,通过对18株肺炎克雷伯氏菌检测全部为阳性、29株其他阴性相关菌株检测为阴性,证明具有良好的特异性.通过对纯菌液、DNA浓度、实际样品检测等四方面进行灵敏度评估,DNA检测灵敏度为75.8fg/反应,纯菌液为96CFU/mL,经增菌步骤,样品中菌体检测灵敏度为9.6CFU/100g.该检测方法通过与参考方法比较其灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确性几方面参数,符合ISO相关要求.该等温扩增方法的灵敏度为98.4%,特异性为98.5%,假阳性率为1.5%,假阴性率为1.6%,相对准确性为98.5%.该方法可用来对食品中肺炎克雷伯氏菌进行快速初筛检测.

鉴定羊肉中掺杂猪肉的LAMP检测方法的优化及应用

为了优化羊肉中掺杂猪肉的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并应用于市售羊肉制品是否掺杂猪肉成分的鉴定,在前期已建立LAMP检测方法的基础上,试验对LAMP反应温度和反应体系进行了优化。结果表明：三磷酸脱氧核苷酸（d NTPs）浓度为1.2 mmol/L,Mg SO4浓度为4.0 mmol/L,甜菜碱浓度为0.8 mol/L,反应温度为72℃,反应时间为55 min,LAMP反应扩增效率最高,荧光最强。采用优化后的反应体系对猪、鸭、鸡、鱼、鼠、羊、马、狐狸、牛9种不同动物来源肉品进行了特异性检测,该方法可以从9种不同动物来源肉品中特异性鉴别猪肉成分。用优化的LAMP检测方法进行市售羊肉卷和羊肉串中猪肉成分的检测,经计算,猪肉成分的检出率为66.7%,而且LAMP与PCR方法的检测结果一致性为100%。

等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假

本文建立了快速鉴定羊肉掺假的等温扩增荧光检测方法。针对羊的线粒体Cytb基因设计两套引物,在恒温下,以直扩法处理的样本为模板进行扩增,通过特异性、灵敏度实验对该方法体系进行验证和分析。结果表明,最佳反应温度为65℃,最低检测限为5.54×10^(-5) ng·μL^(-1)。本研究建立的等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假结果准确可靠、反应快速,具有良好的特异性和灵敏度,可以同时满足实验室和现场检测要求,为快速鉴定羊肉种属提供了一种新的检测方法,为其他肉类种属快速鉴定提供理论依据。

Establishment of Reverse-transcription Loopmediated Isothermal Amplification Method for Detection of Wheat Streak Mosaic Virus

A reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） method was established for the detection of wheat streak mosaic virus （WSMV）. Ac-cording to the conservative regions of the genes that encode the coat protein of WSMV, 2 pairs of primers were designed. Final y, the 1st pair of primers was select-ed through the specificity test. The sensitivity test showed the sensitivity of RT-LAMP method was 10 times higher than that of RT-PCR. In addition, the amplifica-tion of target gene could be judged visual y from the presence of fluorescence （cal-cein） in the final reaction system. The RT-LAMP method, established in this study, was rapid, easy, specific and sensitive. Moreover, it did not require sophisticated equip-ment. The RT-LAMP was suitable for the rapid detection of WSMV.