全柱成像等电聚焦毛细管电泳法对双特异性Fc融合蛋白的电荷异质性分析

建立全柱成像等电聚焦毛细管电泳(WCID-CIEF)分析双特异性Fc融合蛋白电荷异质性方法。方法 通过非还原毛细管电泳法观察酶处理前后峰型的变化,初步确认了该Fc融合蛋白电荷异质性唾液酸相关;结合唾液酸酶酶切和方法优化手段,建立了此融合蛋白的WCID-CIEF分析平台;通过液相质谱法(LC-MS)鉴定了唾液酸相关N-糖构型;通过液相荧光法(LC-FLR)测定了唾液酸的含量。结果 经唾液酸酶酶切和方法优化后,此方法在2.5~7.5 mgmL-1浓度范围内线性良好,R2=0.998,回收率在96.3%~104.6%之间,准确性、专属性和耐用性均满足要求。结论 结合酶处理和方法优化手段,WCID-CIEF可较好地分析融合蛋白的电荷异质性,提供了一种简单、有效的融合蛋白质控手段,并可应用于产品放行及稳定性监测。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术在重组蛋白疫苗电荷异质性分析中的应用

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性。其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一。电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要。开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标。经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析。基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述。

某些灵长类毛发角蛋白的等电聚焦分析

本文用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(PAGIEF)对分属灵长类的5个科的15种动物毛发角蛋白进行了分析,并用激光光密度计对PAGIEF板进行了扫描。结果表明,各种灵长类毛发角蛋白的PAGIEF谱型均有差异。因此,本方法可以用于灵长类动物之间毛发角蛋白组分的鉴别。

毛细管等电聚焦分离蛋白质

采用均匀设计法进行未涂壁石英毛细管等电聚焦研究，考察两性电解质、甲基纤维素、四甲基乙二胺和牛磺酸几种组分对等电聚焦的影响，确定出了比较合适的浓度范围。当中性蛋白质迁移通过检测窗后，在进样端施加一低气压，从而使酸性蛋白质得到很好的分离，适用于较宽的ｐＩ范围。方法的重复性好，为蛋白质分离鉴定提供一种有力的工具。

毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

毛细管等电聚焦/加压毛细管电色谱二维分离体系在多肽分离中的应用

以毛细管等电聚焦(cIEF)为第一维分离模式,以反相加压毛细管电色谱(pCEC)为第二维分离模式,开展离线二维色谱分离研究,并对复杂肽段进行分离。羟丙基纤维素(HPC)涂层的毛细管用于cIEF分离,对6种标准蛋白质的平均分离柱效约为31万。在毛细管末端引进电隔离槽,方便了第一维样品的收集。在加电6 kV下,第二维pCEC对多肽的分离比不加电时的分辨率和分离速度提高。实验中用牛血清白蛋白的酶解肽段对cIEF/pCEC二维体系进行考察,理论峰容量约为30000。将该平台用于人血红细胞破碎液酶解多肽的分离,7个片段共检测到约200个峰。结果表明,cIEF/pCEC二维能较好地完成对复杂多肽的分离。

等电聚焦强度对木薯叶片蛋白质双向电泳分离结果的影响

通过优化等电聚焦强度改良木薯叶片蛋白质双向电泳的分离效果。结果表明,13万Vhs等电聚焦强度能很好地分离木薯叶片蛋白质,且分离的蛋白质具有良好的质谱兼容性。质谱鉴定7个蛋白点,结果显示这些蛋白主要参与能量代谢,其中有些蛋白点是在13万Vhs聚焦强度下特异出现的。

等电聚焦电泳法测定甘蓝自交不亲和性

采用等电聚焦电泳法对１０个甘蓝自交不亲和系、５个亲和系的柱头、花粉蛋白质谱带进行了分析。对比自交不亲和系开花前２～３ｄ的柱头与成熟柱头，发现各试材在等电点为８．３～８．５的区域内有一条特异带，该带在成熟柱头中清晰可见，在开花前２～３ｄ的柱头中没有或较弱。据此特征推断该带即为Ｓ蛋白质特征谱带。以双蒸水和巯基乙醇作为提取液处理花粉，均未发现自交不亲和系共有的特征带。

用等电聚焦法对茄子种子几种同工酶的研究

通过等电聚焦电泳方法对茄子种子进行同工酶分析，发现酯酶和过氧化物酶同工酶酶谱在父本、母本及杂交一代之间有一定的差别，而且这种差别有一定的时间局限性。而酸性磷酸酶的同工酶酶说在茄子的亲本和杂交一代间没有差别。由于茄子种子同工酶酶谱有一定的差别，因此可以利用这种差别来进行种子纯度检验。

优化等电聚焦电泳方法评价重组人红细胞生成素质量

目的对等电聚焦电泳(IEF)分析方法进行优化,以更好地评价重组人红细胞生成素(rHuEPO)产品的质量。方法用优化的IEF方法分析rHuEPO异构体分布,同时参照rHuEPO的体内外生物学活性和唾液酸含量结果,综合评判rHuEPO的质量。结果建立的优化等电聚焦电泳方法分析rHuEPO,图谱清晰,检测结果可靠。结论IEF方法的优化为rHuEPO的质量控制提供了快捷,准确的手段。

等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。

用ACP及ADH同工酶等电聚焦快速鉴定番茄杂种纯度

1 目的与材料方法 不同品种的番茄种子在形态上非常相似,采用田间形态法鉴定其纯度不但占用大量土地,而且周期长,费用大,并受到季节的限制。有的杂交种子甚至缺乏可资鉴定的农艺性状。因此,研究建立一种准确、快速、简便、实用的杂交番茄种子纯度检测技术显得非常重要。

用于蛋白质分析的毛细管等电聚焦-电喷雾质谱接口的改进

An important interface modification for capillary isoelectric focusing mass spectrometry(CIEF MS) is reported. A capillary needle with a sheath flow tube pre mounted in one device serves as both the CIEF cathodic end and the ESI interface. The needle was inserted into the cathode reservoir at the focusing stage, and then removed to the front of sampler orifice of MS at the detection stage. Therefore, the shut off of the high voltage is not necessary and a better focusing protein zone is maintained during the ESI stage. The optimization of the experimental condition has been investigated and the two dimensional image of the E. coli proteins has been obtained, which is comparable with that from a 2D gel.

新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦方法用于蛋白分离

通过化学键合建立一种固定化pH梯度的方法,用于毛细管等电聚焦分离蛋白质。采用微流控泵驱动毛细管内的聚焦区带,通过调节泵的流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。该方法避免了自由溶液聚焦时两性电解质所带来的影响,实现了高灵敏度及检测波长自由选择等优点,适用于两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质等两性电解质。本文考察了对牛血清白蛋白和血红蛋白两种蛋白质混合物的分离,证明了该方法可行。

超薄层等电聚焦电泳技术检验燕麦种子的真实性

利用种子醇溶蛋白超薄层等电聚焦电泳(UTL IEF)技术对青海和河北省燕麦属(A vena spp)16个品种真实性进行了比较分析。结果表明,参试样品的种子醇溶蛋白UTL IEF电泳图谱共分离出34条不同迁移率的谱带;依据蛋白电泳图谱等电点(P I值)为4.8、6.55、6.9、7.7、8.4和8.6等位置谱带的有无以及数目,可鉴别16个参试样品中的13个样品;对同一样品的整粒种子、1/2粒和1/4粒种子,以及人工老化处理获得的同一样品不同发芽率的种子进行超薄层等电聚焦电泳,结果表明破损程度到1/2粒种子和不同生活力种子甚至死种子对电泳鉴定结果基本没有影响。

超薄等电聚焦电泳技术在水稻品种鉴定上的运用

利用超薄等电聚焦电泳技术对 2 0个水稻品种进行了鉴定 ,发现 19条蛋白质带在不同品种间表现出多态性。利用这 19条蛋白质带和种子外观形态上的差异 ,可将 2 0个品种中的 11个品种完全区分开 ,另外 9个品种可分为两组。

野生纤毛虫同工酶微量等电聚焦分析探索

微量电泳是用来分离和表征提取于少量生物材料中的核酸和蛋白质的分析技术。作者以缘毛目螅状独缩虫(Carchesium polypinum Linne,1758)为材料,用微量等电聚焦(Microisoelectric focussing)探索了分析野生纤毛虫同工酶的可行性。实验结果表明:(1) 样品量小至两个群体螅状独缩虫(约200个个体)即可进行酯酶同工酶微量等电聚焦分析;(2) 自野外采集材料中立即分离制备的螅状独缩虫匀浆上清液的酯酶同工酶酶谱与实验室内放置10h后分离制备的酶谱几乎一致。因此,野生纤毛虫同工酶可用微量等电聚焦进行分析。

中药青葙子、土鳖虫的等电聚焦电泳研究

应用等电聚焦电泳（isoelectricfocusingelectrophoresis简称IFE）技术，对果实种子类中药育葙子CelosiaargenteaL．和动物类中药土鳖虫EupolyphagasinensisWalk进行IFE研究。结果表明，清晰的电泳港带既可作为鉴别药物纯度及真伪的依据，也可用于确定药物样品所含主要蛋白质成分的等电PH，从而为中药材及其制剂的生产、贮藏提供定量参考数据。

大白菜一代杂种及双亲幼苗的等电聚焦电泳过氧化物同工酶分析

等电聚焦电泳是近些年发展起来的分离蛋白质的有效生化技术．操作简便，分辨率高，电泳条带多而且细，信息量大，利于进行深入细致的研究。该文利用等电聚焦丙烯酰胺电泳方法分析了6个大白菜一代杂种及双亲幼苗的过氧化物同工酶电泳图谱，共分离出十几条酶带，F1杂种与亲本间同工酶图谱均表现出明现差异，特别是A鉴别区内的酶带差异最明显，大多为互补型，是主要鉴别区。进一步研究结果表明，6个大白菜品种均可利用过氧化物同工酶鉴别由自交引起的假杂种。利用这项技术大量开展了这6个品种的商品种子纯度检测工作，同时在田间进行了验证性测定，二者结果基本相符。

毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维蛋白质分离平台的构建及其性能

A two-dimensional separation platform of capillary isoelectric focusing(CIEF)-capillary zone electrophoresis(CZE) for proteins was constructed by a microdialysis hollow fiber interface. The interface provided ease of fabrication,speed of mass delivering and convenience of column switching. Chrome c was selected to demonstrate the 2D separation systems feasibility and resolving performance. The 2D separation system was found to greatly increase the resolving power and overall peak capacity over those obtained for either dimension alone.