LPS对鹅等级卵泡基质层TLR家族基因表达的影响

【目的】研究鹅卵泡基质层TLR家族基因表达谱及其对LPS不同处理时间后的反应性。【方法】在大群散养条件下,实时观察鹅产蛋过程,分别在产蛋后8和2 h以及产前4、16和28 h注射LPS,并在产蛋后8h屠宰,即LPS作用0、6、12、24和36 h,每个时间点各5只鹅。屠宰时,取卵巢,观察卵泡外观形态,并分离F1-F5级卵泡基质层。试验鹅自由饮水、自由采食、自然光照。LPS处理0、24和36 h的单个F1-F5级卵泡基质层或卵泡用于基因表达分析,而其他LPS处理的每只鹅等级卵泡基质层RNA等质量混合后用于基因表达分析。采用普通PCR方法检测10种鸟类TLR家族基因的在鹅等级卵泡基质层的表达谱,其中以脾脏组织为阳性对照,以不加c DNA模板为阴性对照。根据RT-PCR的表达谱结果,采用Real-time PCR检测不同等级卵泡基质层TLRs表达水平以及不同LPS处理时间对基质层TLRs表达水平的影响。对不同等级卵泡和不同LPS处理时间对基质层TLRs表达的数据,采用单因子方差分析,Duncan法多重比较;对变性卵泡与对照组基质层TLRs表达水平的数据,采用T检验分析。【结果】(1)已公开的10种鸟类TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2A、2B、3、4、5、7、15和21基因均在等级卵泡基质层组织中表达。(2)随等级卵泡生长,TLRs 2A和15表达水平逐渐升高;F1级卵泡基质层TLR2A表达水平显著高于F3、F4和F5级卵泡,TLR15表达水平显著高于F5级卵泡;其他TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2B、3、4、5、7和21在不同等级卵泡基质层中的表达水平差异不显著。(3)在LPS处理0、6和12 h时,等级卵泡外观形态无明显变化,但在LPS处理24 h时,3只鹅的等级卵泡呈深黄色胶冻状变性;在LPS处理36 h时,全部试验鹅等级卵泡呈深黄色胶冻状变性。(4)与对照组(LPS处理0 h)相比,TLRs 2A、4和5表达水平在LPS处理12和24 h时显著升高,TLR2B表达水平在LPS处理24 h时显著升高,TLRs 7和15表达水平在LPS处理6-24 h期间均显著升高,而TLRs 1A、1B、3和21表达水平在LPS处理6-24 h期间差异不显著。(5)与等级卵泡基质层相比,在LPS处理24和36 h的变性卵泡中,TLRs 1A、2A、2B、4、5、7和15表达水平显著升高,TLR3表达水平显著降低,而在LPS处理36 h的变性卵泡中,TLRs 1B和21表达水平显著升高。【结论】已发现的10种鸟类TLR家族基因均在种鹅等级卵泡基质层表达,且随LPS作用时间延长,等级卵泡形态结构发生变化,但TLRs表达水平逐渐升高。

前列腺素对禽类等级卵泡发育的影响

前列腺素是一类由花生四烯酸通过环氧化酶途径合成的脂类介导物。在哺乳动物排卵、受精、胚泡植入、蜕膜化、子宫平滑肌收缩、黄体退化及卵泡发育过程中起重要作用。对于家禽,前列腺素促进其产卵和子宫收缩;在产卵中期,卵巢静脉血浆中前列腺素的浓度为外周血浆浓度的5～20倍。这种高剂量、脉冲式分泌的前列腺素不仅能促进家禽成熟卵泡的排卵,而且可作为促性腺激素的第二信使介导颗粒细胞对cAMP的反应,促进了等级前卵泡颗粒细胞的增殖,进而在优势卵泡的选择过程中起重要作用。

鹅等级卵泡颗粒细胞层形态观察及卵泡激素受体表达研究

通过对鹅卵泡中的颗粒细胞层进行形态学观察和分析,为在颗粒细胞水平深入研究鹅卵泡的选择与发育过程奠定形态学基础。采集处于产蛋期的皖西白鹅大白、F5、F3和F1卵泡,福尔马林固定后制作石蜡切片,H&E法染色,光镜观察颗粒细胞层形态;机械法分离F5卵泡颗粒细胞,提取总RNA,Real-time quantitative PCR(q RT-PCR)检测分析鹅等级卵泡促卵泡素受体(follicule stimulating hormone receptor,FSHR)mRNA、促黄体素受体(luteinizing horomone receptor,LHR)mRNA表达情况。结果表明:鹅卵泡颗粒细胞层厚度随等级卵泡发育表现为先增加后下降;与卵泡等级发育和排卵相关的FSHR mRNA表达伴随卵泡发育先增加后降低,LHR mRNA表达伴随卵泡发育持续增加。

母鸡卵巢中不同等级卵泡的闭锁研究

在产蛋高峰期,母鸡的卵巢中含有30~100个卵黄色卵泡,直径在1~8mm之间。一般母鸡体内卵泡数量与卵泡直径成反比,例如鸡体内有约20个直径为1~2mm和1个直径为7~8mm的卵泡,直径>8mm的卵泡数约为4~7个。本研究通过苏丹黑B染色法发现:鸡卵泡生长至3~5mm大约需要3d,再生长至5~8mm大约需要2d,生长至8mm到排卵需要6d。由于染料无法进入较小的卵泡,因此本试验没有检测到1~3mm之间的数据。研究也发现鸡体内含有5~25个闭锁卵黄色卵泡,这对于高产鸡是正常现象,但在整个试验中,只观察到一个闭锁的大卵黄色卵泡。因此本试验以这两种闭锁水平来定义不同卵泡的大小。本研究得出,鸡的排卵率经两种互补机制进行调控,一种促进卵泡在起始阶段的生长,另一种使小卵黄卵泡闭锁,抑制卵泡生长。

鸡前等级卵泡中RAC1基因的表达

为探讨RAC1基因在鸡前等级卵泡的表达特性及定位,本试验以海兰褐蛋鸡为供试材料,采用半定量RT-PCR方法对RAC1基因在鸡前等级卵泡组织中的mRNA表达水平进行测定分析,并进一步采用免疫组化的方法对RAC1蛋白在前等级卵泡的表达模式进行蛋白质定位研究。结果表明,RAC1基因在鸡不同直径的前等级卵泡内均有表达,但表达丰度存在一定的差异,在直径6~8 mm卵泡中相对表达量显著高于直径4~5.9,1~3.9 mm的卵泡(P<0.05);RAC1蛋白主要在卵母细胞、颗粒细胞和膜层细胞中表达,且主要分布在细胞质中,为进一步研究RAC1在鸡前等级卵泡发育中的作用提供了理论基础。

鹅等级前卵泡组织转录组测序分析

为研究鹅等级前卵泡组织的转录组差异,丰富鹅卵泡转录组数据信息,实验选用3只经产处于高峰期的籽鹅等级前卵泡,通过Illumina Hi Seq 2500测序平台进行测序,并进行序列分析和注释。经测序质检后共得到224 929214条序列,31 722 729 162 bp碱基,且质量大于20的碱基比例高于95%,从头拼装后得到114 486条Unigenes序列和145 020条Transcripts序列,通过比对分析共有42 453条序列注释到NR数据库,并进行物种同源性比对,发现绿头鸭与其同源性最高,通过GO数据库比对,发现共有1 045条Unigenes注释到GO数据上,主要涉及生物过程、分子功能和细胞组分。结果表明,共有11 949条Unigenes比对到KEGG数据库,共涉及到341条通路,其中癌症通路、PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路显著富集。为验证基因表达差异,以FPKM值作为基因的表达量,FDR<0.05,︱log FC︱≥1为标准筛选差异基因,其中以SY等级卵泡为参考,在PE等级卵泡组织间中得到15 516条差异基因,其中上调基因8 293条,下调基因7 223条。并对筛选得到的所有差异基因进行GO和KEGG比对。本实验条件下,测得各等级卵泡之间基因表达差异较大,且癌症通路、PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路较为活跃,可间接证明这3条通路对鹅等级卵泡发育影响较大,这对进一步分析鹅等级前卵泡发育机制提供基础。

3-硝基丙酸对鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

鸡等级卵泡颗粒细胞培养24 h后,在培养基中加入10、5、2.5 mmol/L的3-硝基丙酸(3-NPA)继续培养24 h。利用活性氧(ROS)试剂盒检测细胞中ROS的含量;采用ELISA检测细胞上清中孕酮(P4)含量,并采用qRT-PCR技术检测类固醇生成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)及3β-类固醇脱氢酶(3β-HSD)mRNA的相对表达量,以检测3-NPA对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果,加入3-NPA培养24 h后,10、5、2.5 mmol/L组细胞中ROS含量相对于细胞对照组均显著升高(P<0.05);各组细胞上清的孕酮分泌量并无显著差异,而10、5、2.5 mmol/L组细胞中StAR、P450scc、3β-HSD mRNA的相对表达量相对于细胞对照组均极显著降低(P<0.001)。上述结果说明,3-NPA会导致鸡等级卵泡颗粒细胞的ROS生成并能显著降低StAR、P450scc、3β-HSD mRNA的相对表达量。

利用转录组测序分析GRB2和SOS基因在籽鹅等级前卵泡中的mRNA表达

为研究生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein 2,GRB2)和SOS(Son of sevenless)基因组在籽鹅等级前卵泡中的表达情况,本研究采用高通量测序技术对籽鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,之后通过荧光定量PCR进行验证。通过FPKM值进行分析,GRB2和SOS在籽鹅等级前卵泡中均有表达。随着卵泡的发育,GRB2在小白卵泡中表达量最低,在初级卵泡中表达量最高;SOS在大白卵泡和中白卵泡中的表达量最低,在初级卵泡中的表达量最高。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本一致。

CDKN1A、CDKN1B基因在蛋鸡等级前卵泡组织中的时空表达模式研究

为了探讨CDKN1A、CDKN1B在蛋鸡卵泡中的表达规律和模式,采用半定量RT-PCR和免疫组织化学的方法分别检测CDKN1A、CDKN1B mRNA及其蛋白在蛋鸡卵泡中的表达模式分析。结果表明:CDKN1A、CDKN1B基因在等级前卵泡中mRNA整体表达水平显著高于等级卵泡表达水平。CDKN1A、CDKN1B蛋白主要在等级前卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中表达。研究结果揭示了CDKN1A和CDKN1B基因有可能参与蛋鸡卵泡的发育调控过程。

鹅等级前卵泡中FOXO3及细胞凋亡和自噬相关基因mRNA的表达分析

为探明不同产蛋阶段鹅等级前卵泡中FOXO3基因与凋亡和自噬相关基因的mRNA表达情况,采用荧光定量PCR方法检测开产前、产蛋初期和产蛋高峰期鹅等级前卵泡中FOXO3基因及Bcl-2、Bax、Caspase3、Fas、Fasl、LC3、Beclin1等凋亡和自噬相关基因mRNA的表达情况。结果显示:凋亡和自噬相关基因在鹅产蛋周期不同阶段等级前卵泡中均有表达;产蛋高峰期FOXO3、Bcl2、Bax、Caspase3、Fas和Fasl的mRNA表达量随卵泡直径变大呈增加趋势,LC3和Beclin1的表达量随卵泡直径变大呈减少趋势;产蛋初期各基因的表达变化不一致。由此可见,鹅等级前卵泡中FOXO3基因的表达随着卵泡的发育而增加,且其表达变化趋势与凋亡相关基因基本一致,但与自噬相关基因的变化趋势相反,推测FOXO3基因可能与鹅卵泡颗粒细胞的凋亡和自噬有一定关联。

胰岛素样生长因子-Ⅰ对鸡等级前卵泡发育的促进作用

【目的】探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对产蛋鸡等级前卵泡发育的影响。【方法】用免疫组化和RT-PCR法检测IGF-I受体在鸡等级前卵泡中的表达,研究IGF-I对鸡早期卵泡发育的影响。【结果】IGF-I受体在等级前卵泡颗粒层和膜层均有表达,且随着卵泡的发育其表达水平逐渐增高,在小黄卵泡(SYF)阶段达到最大;同时,卵泡体外培养结果表明IGF-I(100 ng.mL-1)、FSH(10 n.mL-1)及IGF-I+FSH处理可显著增加SYF中膜层和颗粒层的厚度及细胞密度,且IGF受体在颗粒层和膜层中的表达水平也显著增加,其中以IGF-I+FSH联合处理组的效果最为显著。【结论】IGF-I能显著提高产蛋鸡SYF颗粒层和膜层的细胞数目以及厚度,同时增加IGF-I受体的表达,并可与FSH联合作用以提高IGF受体的表达,促进鸡卵泡细胞的增殖,进而调节鸡等级前卵泡的发育,此结果有助于揭示家禽卵泡发育的局域性内分泌调节作用。

番鸭等级前卵泡发育规律及生殖激素变化的研究

为探索番鸭等级前卵泡发育过程中主要生殖激素及卵泡发育的变化规律,试验以同批孵化、饲养条件相同、体况相近的产蛋期番鸭为对象,分别采集小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、大黄卵泡(LYF)。通过组织形态学方法观测卵泡的发育情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定激素水平。结果表明:在等级前卵泡发育过程中,促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)呈现上升的趋势,且LYF时期浓度最高,差异不显著(P<0.05);而孕酮(P4)和雌二醇(E2)均呈现下降趋势,从SWF至SYF时期极显著下降(P<0.01),SYF至LYF时期,下降不显著(P>0.05)。伴随卵泡的发育,颗粒细胞层和卵泡膜层不断增厚,且卵泡膜厚度在LWF至LYF时期增长极显著(P<0.01)。由此可见,FSH、LH、P4、E2在番鸭等级前卵泡发育中起重要作用,且SYF阶段是番鸭等级前卵泡发育的关键阶段。

鹅等级前卵泡中TGF-βⅠ和TGF-βRⅡ基因mRNA的表达分析

为了探究两种可能引起卵泡闭锁的基因转化生长因子βⅠ(TGF-βⅠ)、转化生长因子受体βⅡ(TGF-βRⅡ)在鹅等级前卵泡内是否表达,试验选择处于产蛋高分期的籽鹅,采集其等级前卵泡并提取总RNA,采用荧光定量PCR的方法计算目的基因在等级前卵泡中的相对表达量。结果表明:目的基因在鹅的各个等级前卵泡中均有表达,且在M等级卵泡中表达量相对最高,在pe等级卵泡中表达量相对最低。提示TGF-βⅠ、TGF-βRⅡ对鹅的卵泡闭锁现象可能起到一定作用。

番鸭等级前卵泡颗粒细胞体外培养模型的建立

试验旨在建立番鸭等级前卵泡颗粒细胞的体外培养模型,为研究番鸭的就巢性和提高产蛋性能提供试验基础。在体外分离培养番鸭小黄卵泡颗粒细胞,探究不同的消化酶(12.5 g/mLⅡ型胶原酶、0.1%Ⅱ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶)、消化时间(3 min、5 min、8 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min和40 min)和血清浓度(含0.5%、1%、2.5%、5%和10%FBS的M199完全培养液)对颗粒细胞增殖的影响,筛选最佳消化体系和培养体系。结果显示:用0.1%的Ⅱ型胶原酶在37℃、5%CO2培养箱中消化8~10 min可获得较优的颗粒细胞;对于刚分离到的颗粒细胞用含0.5%FBS的M199完全培养液先培养24 h后换成无血清的培养液培养,既能维持增殖活性和细胞形态,又能满足后续试验的需要。

不同类型蛋鸡品种卵巢及卵泡发育变化规律分析

研究旨在分析地方特色蛋鸡与高产蛋鸡卵巢及卵泡发育规律,为地方鸡种质资源开发利用提供参考依据。以神丹6号绿壳蛋鸡和海兰褐蛋鸡为素材,分析13~60周龄卵巢及各级卵泡发育变化规律。13~28周龄每周、30~40周龄每两周、40~60周龄每4周每个鸡种随机选择12只左右母鸡进行屠宰,分别统计等级卵泡(直径>8mm)、小黄卵泡(直径4~8mm)和大白卵泡(直径2~4mm)的数量和重量,并将上述卵泡去除后对卵巢基部进行称重作为卵巢重。结果显示:两个鸡种在开产前卵巢和大白卵泡发育缓慢,而开产后迅速发育,神丹6号绿壳蛋鸡在16周龄时有小黄卵泡发育,海兰褐蛋鸡在17周龄时有小黄卵泡发育,整体上海兰褐蛋鸡卵巢发育的整齐度优于神丹6号绿壳蛋鸡。产蛋率50%至60周龄期间神丹6号绿壳蛋鸡和海兰褐蛋鸡卵巢重分别为4.33g和5.15g,小黄卵泡数分别为13.2个和15.2个,等级卵泡数分别4.9个和6.0个,上述指标神丹6号绿壳蛋鸡均显著低于海兰褐蛋鸡(P<0.05),而神丹6号绿壳蛋鸡大白卵泡数为19.9个,显著高于海兰褐蛋鸡的17.7个(P<0.05)。结果表明:卵巢重、小黄卵泡数和等级卵泡数在地方特色蛋鸡和高产蛋鸡产蛋期具有显著差异是导致产蛋性能差异的重要因素。

NPFFR1基因对鹅卵泡颗粒细胞激素分泌和细胞凋亡的影响研究

神经相关肽受体(RFamide-related peptide receptor,NPFFR1)是促性腺激素抑制激素的主要亲和受体,它在调控动物繁殖方面起着重要作用。为了解NPFFR1对鹅卵巢卵泡发育的作用,本研究以42周龄健康产蛋四川白鹅为试验材料(n=9),利用RT-qPCR法检测NPFFR1基因在等级前和等级卵泡颗粒细胞中的mRNA表达规律;在颗粒细胞中过表达NPFFR1基因,酶联免疫吸附法检测颗粒细胞上清液(n=9)中雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P4)和抗缪勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)的浓度变化,剩余贴壁细胞作一步法TUNEL检测细胞凋亡情况;转录组测序方法筛选大黄卵泡(8~10 mm)颗粒细胞过表达NPFFR1前后表达差异显著基因,并对差异表达基因进行功能聚类分析。结果显示,除F1等级外,其余等级卵泡颗粒细胞NPFFR1表达量均极显著高于等级前卵泡(P<0.01);过表达NPFFR1后,等级颗粒细胞上清液中的E2和等级前颗粒细胞上清液AMH的含量显著(P<0.05)降低,但孕酮P4含量变化不显著(P>0.05);转录组测序共筛选到267个差异表达基因(119个下调,148个上调),这些基因主要富集在生物节律过程、繁殖进程等生物学过程中;同时,与对照组相比,差异基因AMH显著下调表达(P<0.05),Clock(clock circadian regulator)、FOS(proto-oncogene,AP-1 trans-cription factor subunit)、Per(period circadian regulator)和ANTXR2(cell adhesion molecule 2)分别极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)上调表达。上述试验结果提示,NPFFR1可从激素、细胞凋亡和生物节律等多个环节影响卵泡颗粒细胞,参与调控卵泡的时序等级发育。

如皋黄鸡不同产蛋时期卵巢卵泡变化规律分析

为探索不同产蛋时期如皋黄鸡卵巢卵泡变化规律,选取预产期(16周龄)、产蛋初期(20周龄)、产蛋高峰期(27周龄)、产蛋末期(64周龄)如皋黄鸡蛋鸡,对输卵管、卵巢重量、等级前卵泡数进行统计,同时卵巢进行组织切片HE染色后对原始、初级、次级卵泡进行了观察和测量统计,对不同阶段卵泡的数量变化进行了比较分析。结果表明:随产蛋时期的推进,卵巢、输卵管重呈上升趋势,4种等级前卵泡数量在产蛋高峰期达最高值;次级卵泡数量在预产期最高,不同直径的次级卵泡数量在产蛋期进程中变化规律有所不同;此外,初级卵泡平均直径在不同产蛋时期亦有差异。

小鼠 鸡卵巢颗粒细胞分离 培养方法的比较与优化

本试验通过分离与培养小鼠、鸡不同等级卵泡颗粒细胞,比较其培养和形态差异,并对提取方法进行优化。试验选取3周龄雌性昆明系小鼠,200日龄的海蓝褐蛋鸡,分别采用优化的方法分离培养卵巢颗粒细胞,通过观察细胞形态、H.E.染色和间接免疫荧光,对比不同种属颗粒细胞提取方法、培养条件及生长状态。结果表明,与采用机械法分离的小鼠卵巢颗粒细胞相比,采用酶消化法分离的鸡不同等级卵泡颗粒细胞贴壁较快、生长速度快、伪足较多。分析得出小鼠与鸡不同等级卵泡颗粒细胞的分离,培养条件均有差异,且对已有提取方法进行优化,所培养的颗粒细胞状态良好。

神经生长因子mRNA在鹅等级前卵泡中的表达

采用相对荧光定量PCR(RT-PCR)相对标准曲线方法,对籽鹅和卡洛斯鹅不同产蛋时期初级卵泡、小白卵泡、中白卵泡和大白卵泡中神经生长因子(NGF)mRNA的表达量进行研究,同时检测血液中促卵泡素(FSH)的含量,并与NGFmRNA表达量进行相关性分析。结果表明:产蛋高峰期,籽鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量极显著高于其他卵泡(P<0.01),卡洛斯鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量显著高于中白卵泡(P<0.05),其余卵泡间差异不显著。产蛋末期,籽鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡和小白卵泡(P<0.01),大白卵泡NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡(P<0.01),卡洛斯鹅初级卵泡NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡和小白卵泡(P<0.01),大白卵泡极显著高于其他卵泡(P<0.01)。2种鹅产蛋高峰期血液中FSH表达水平高于产蛋末期(P<0.05);籽鹅和卡洛斯鹅的小白卵泡NGF mRNA表达量与血液中FSH的表达水平呈显著正相关(P<0.05),在大白卵泡中两者呈负相关,其他卵泡呈正相关。

转录组学分析鹅等级前卵泡中多胺代谢关键酶的差异表达

为了解多胺代谢关键酶亚精胺合成酶(spermidine synthase,SRM)、精胺合成酶(spermine synthas,SMS)和精胺氧化酶(spermine oxidase,SMOX)在鹅等级前卵泡中的表达情况,本研究基于高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并通过荧光定量PCR对结果进行验证。通过FPKM值计算分析,这3个基因在鹅等级前卵泡中均有表达,且随着卵泡的发育,SRM和SMS的表达呈现先降低后增加再降低的趋势,在初级卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低;SMOX的表达则呈现先增加后降低的趋势,初级卵泡中的表达量最低,中白卵泡中的表达量最高。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。结果证实SRM和SMS对卵泡的发育有促进作用,而SMOX可能参与卵泡闭锁过程。