短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.

厌氧流化床反应器微生物固定化载体筛选的研究

论述了在厌氧流化床（ＡＦＢ）反应器中用包络法固定微生物的高分子载体筛选研究的情况，通过静态试验的对比，筛选出了微生物固定化效果好、产甲烷性能优良的聚丙烯酸酯类多孔高分子载体ＷＡＲ－８．用ＡＦＢ反应器进行合成葡萄糖废水的中温厌氧消化试验，达到了较高的处理性能指标。通过扫描电镜观察，发现厌氧微生物不仅可以固定于高分子载体的外表面，而且能固定于载体的内层表面，载体上菌群丰富，生长发育良好．

牛粪厌氧发酵的载体筛选试验研究

为了提高厌氧发酵装置的效率,人们研究了各种各样的方法和措施,其中应用填料或载体使生物菌能够延长驻留期是其中的方法之一,开展载体筛选及其结构设计在厌氧发酵装置中的试验,有助于对此问题的深入研究以及将其成果应用于生产实践。通过静态载体筛选试验选择了玻璃纤维作为载体、PVC塑料管作为载体骨架制成的装置在动态序批式厌氧发酵装置中进行了试验。结果表明:此载体骨架结构对于牛粪动态厌氧发酵具有明显的提高产气效率、改变产气质量和促进有机物转化为挥发性脂肪酸的作用。

基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证

旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。

利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记的新型pUC18筛选载体。方法将EGFP基因克隆至pUC18载体的PstI/HindⅢ位点,构建筛选载体pUC18-EGFP,并验证pUC18-EGFP能否利用EG-FP的荧光特性筛选出含基因重组体的阳性克隆。结果经酶切和基因测序鉴定pUC18-EGFP载体构建正确;在外源基因插入该载体后,对LB氨苄平板上的绿色菌落进行酶切和基因测序鉴定,结果证明LB平板上的绿色菌落即为含有重组质粒的克隆。结论成功构建pUC18-EGFP筛选载体,利用EGFP的绿色荧光可筛选出阳性克隆。

黑曲霉(Aspergillus niger)启动子的克隆及其序列特征

应用启动子筛选载体（Promoter-trapvector）pLX2A构建了1个黑曲霉（Asperyillusniger）基因组文库。这个载体含有1个潮霉素B（Hy）磷酸转移酶编码基因（hph），它能以启动子活性选择DNA片段。用这个基因组文库转化大肠杆菌，获得了80000转化子菌落，其中94％含有插入片段。用这个基因库的质粒DNA转化黑曲霉，产生了53个抗潮霉素B（HyR）菌落。21个转化子的Southern杂交分析证明，hph基因已整合到黑曲霉基因组上。用同胞选择法（Sibselection）从此基因库中识别出1个有功能的启动子PX27，并测出了其2条DNA链的序列。它的序列与已知数据库中的序列没有明显的相似性。与已知黑曲霉启动子序列的比较分析得知，黑曲霉启动子含有共同序列CTTCTC，或许这个共同序列对黑曲霉启动子的结构是重要的。

辣椒溶杆菌Lysobacter capsici X2-3遗传操作体系的建立

辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)X2-3是本实验室从小麦根际土壤中分离的对多种植物病原真菌和卵菌有明显拮抗活性的菌株,建立有效的遗传操作体系对了解其基因的功能具有重要意义。本研究以VgrG为目标基因,比较了不同载体对X2-3基因敲除效果,结果发现,载体pEX18GM、pBR325和pK19mob转化X2-3后,均未得到VgrG缺失突变体;而载体pKMS1转化X2-3后,经10%蔗糖二次筛选、PCR和Southern blot验证等,成功得到VgrG缺失突变体;用广宿主载体pBBR1MCS-5构建的VgrG互补突变体,可以恢复VgrG基因的功能。本结果为进一步研究该菌的基因功能提供了技术保障。