当归简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立及优化与品种(系)间遗传关系研究

目的:建立并优化当归简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系并对6个当归品种(系)的遗传关系进行研究。方法:以ISSR-PCR扩增结果为指标,Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板用量为5因素,通过正交、单因素试验优化ISSR-PCR体系。应用优化体系对6个不同品种(系)的当归样本进行遗传关系分析。结果:当归ISSR-PCR最佳反应体系为在20μl反应体系中含Mg2+(10×PCR Buffer)1.5 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.6 U、dNTPs 0.375 mmol/L、引物0.3μmol/L、DNA模板42 ng。6个当归品种(系)的多态性位点百分率为13.04%,Nei’s基因多样性指数为0.058 0,Shannon多样性指数为0.082 7。结论:建立的当归ISSR-PCR体系可用于当归分子遗传学研究,6个当归品种(系)间遗传差异较小。

多伞阿魏简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立和优化

目的:建立并优化多伞阿魏简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系。方法:通过单因素试验确定影响多伞阿魏ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板最佳水平范围。对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素4水平的正交试验,优选最佳ISSR-PCR体系条件。ISSR-PCR扩增结果用SPSS 18.0统计软件分析。结果:不同水平的因素对PCR均有明显影响,其中Mg2+、dNTPs、引物影响最大。多伞阿魏ISSR-PCR最佳反应体系为:在50μl的反应体系中含有10×Taq Buffer 5μl、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1.75 u/50μl、DNA模板0.25 ng/μl。在此基础上,从100条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的多伞阿魏ISSR-PCR体系具有较高的稳定性和重现性,可为进一步利用ISSR技术进行多伞阿魏遗传多样性分析、不同种源鉴定及亲缘关系分析提供基础。

石蒜属植物种质资源ISSR-PCR反应体系的建立

为进一步开展石蒜属Lycoris植物种质资源遗传多样性研究,利用正交试验设计的方法,从Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物等5因素4水平,对石蒜属植物ISSR(intersimple sequence repeats)反应体系进行优化,确立了石蒜属植物ISSR的最佳反应体系:在20μL反应体系中,含1×Buffer,模板DNA 50 ng,2.5 mmol.L-1氯化镁(MgCl2),0.15 mmol.L-1dNTP,25.05 nkatTaq聚合酶,0.5μmol.L-1引物。进一步进行梯度退火试验,确定最适宜退火温度为57℃。

濒危树种格氏栲ISSR-PCR反应体系的建立

以濒危珍稀树种格氏栲为材料,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选。首次建立可用于格氏栲ISSR-PCR分析的反应体系:20μL PCR反应体系中包括1 ng.μL-1模板DNA,0.10 mmol.L-1dNTP,2.0μL 10×PCR buffer(缓冲液),0.2μmol.L-1引物,0.037 5 U.μL-1 Taq酶,11.3μL ddH2O,2.0 mmol.L-1 MgCl2。扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,复性45 s,72℃延伸1.5 min,循环34次,最后72℃延伸10 min,4℃保存。

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础。方法:应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2+、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系。结果:优化后25μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2+、2.5μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 U Taq DNA聚合酶。结论:建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系。

迎红杜鹃ISSR-PCR反应体系建立

利用正交设计L16(45)方法对迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)ISSR-PCR(Inter-simple sequence repeat-Polymerase chain reaction products)反应体系的5因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、DNA模板、dNTP、引物)在4个水平上进行了优化试验。结果表明,ISSR-PCR反应体系各因素在设定的不同水平对PCR反应结果都有影响,其中引物浓度的影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立的迎红杜鹃ISSR-PCR反应最佳体系(25μL)为2.0μL10×Buffer、0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μLDNA模板(20ng/μL),2.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、2μL引物(10μmol/L)。

烤后烟叶SSR反应体系的优化研究

以烤烟RG11品种为原料,研究烤后烟叶简单重复序列(SSR)分析中聚合酶链式反应(PCR)体系各主要因素及其之间的相互作用对SSR扩增的影响,结果表明:烤后烟叶SSR-PCR反应最佳体系为20μL体系中含35 ng模板DNA,1.5 U TaqDNA聚合酶,2.375 mmol/L MgCl2,0.6 mmol/L dNTPs和0.4μmol/L引物.

山乌桕叶片DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

为研究南方优良乡土彩叶树种山乌桕的遗传多样性,并为山乌桕种质培育研究提供技术参考。以山乌桕叶片为试验材料,对山乌桕ISSR-PCR反应体系进行优化,比较试剂盒法、改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基硫酸钠(SDS)法对山乌桕叶片DNA的提取效果,并利用单因素试验和L 25(53)正交试验对DNA模板用量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、退火温度和循环次数进行优化。结果表明,试剂盒法和改良CTAB法均可获得较高浓度和质量的DNA,都是提取山乌桕叶片DNA的良好方法;山乌桕叶片ISSR-PCR反应体系中,DNA模板用量对扩增效果影响最大,2×Taq Master Mix添加量的影响最小;山乌桕叶片ISSR-PCR的最优反应体系为:总体积20μL,其中含20 ng DNA模板1.5μL、2×Taq Master Mix 8.0μL、引物浓度0.8μmol·L^(-1)。山乌桕叶片ISSR-PCR的反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、51.9℃退火45 s、72℃延伸90 s、40个循环,72℃延伸10 min、4℃保存。

15重快速STR复合扩增体系的构建

目的建立一套15重快速STR复合扩增体系。方法选择14个常染色体基因座以及1个性别基因座,采用Fast Start Taq DNA聚合酶系统,以DNA标准品9947A为模板,通过筛选扩增条件、选择热启动酶用量、调整引物平衡、优化快速扩增程序、筛选反应缓冲液、选择反应体系以及筛选添加剂等一系列复合扩增实验,比较各条件下等位基因丢失和非特异性扩增情况。结果在以1 ng DNA为模板、0.4μL聚合酶及10×Fast Start高保真反应缓冲液构成10μL快速体系的条件下,32 min即可获得标准DNA全部15个STR基因座的完整分型,无等位基因丢失和非特异性扩增现象,等位基因均衡性良好。同时,5%甘油、0.01%明胶、0.05%明胶和5 mmol/L硫酸铵可作为PCR扩增过程中拟加入的反应添加剂。结论本研究建立的15重快速STR复合扩增体系可以明显缩短反应时间,提高样品检测效率。

大肠重复癌微卫星不稳定性研究

目的 探讨微卫星不稳定性 (MSI)在大肠重复癌与单发大肠癌中的变化规律。方法 PCR SSLP法对 38例大肠重复癌患者的 5 1例癌灶及对照 35例单发大肠癌分别进行 5个碱基序列位点MSI检测。结果 大肠重复癌中复制错误 (RER)阳性率为 5 2 .9% (2 7/5 1) ,对照组为 17.1% (6 /35 ) ,两组差异有非常显著意义 (χ2 =11.2 5 ,P <0 .0 1)。大肠重复癌组中 ,RER阳性与低分化、近端大肠密切关联。RER阳性组与阴性组在年龄、性别、是否伴有转移、Dukes分期上未见异常。结论 MSI在大肠重复癌的发生上起着重要作用 ,MSI可作为预测大肠重复癌发生的有用标志 ,对MSI大肠癌患者应警惕多重癌发生的可能性。

法医DNA检验中快速复合扩增体系的建立

目的:建立快速法医DNA检验的复合扩增体系。方法:应用chelex法提取血样DNA,聚合酶链式反应复合扩增,非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳银染分型。结果:该方法缩短了检测时间,节省了人力和财力。结论:该方法快速可行,在法医DNA检验中具有较高的应用价值。

应用ISSR-PCR对10个菊花品种进行遗传多样性分析

中国的菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)品种数量众多,形态变异丰富,适应性强,分布广泛,遗传背景非常复杂,这为菊花品种的资源调查、分类鉴定、遗传多样性分析等带来了困难。试验采用分子标记技术,对福白菊(C.morifolium cv.Fubaiju)、杭白菊(C.morifolium cv.Hangbaiju)等10个菊花品种进行了分类鉴定及亲缘关系研究,结果显示,在简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应(Inter-simple sequence repeat-Polymerase chain reaction,ISSR-PCR)分子标记反应体系及引物的筛选方面,选择了条带数量多和清晰度高的菊花反应体系,应用野生福白菊对39条ISSR引物进行了筛选,淘汰了扩增效果差、带型不易辨认的引物,最终确定12条引物用于菊花品种的鉴定。ISSR-PCR聚类分析结果表明,12条ISSR引物扩增出了185条清晰的、重复性好的ISSR条带,其中多态性条带有176条,多态性比率高达95.1%。应用NTSYS 2.10e软件进行UPGMA法聚类分析,在相似系数0.55处可将10个菊花品种大致分为3类,结果福白菊与其他杭菊品种在遗传上有较大的差异。

基于PCR技术的中药指纹图谱研究

指纹图谱技术已经应用于中药研究的许多领域.这类技术可以分为两大类,一类为基于光谱和色谱技术的化学指纹,从某种意义上讲,中药的指纹图谱可以被定义为中药经适当处理后通过光谱、色谱以及分子标记技术等现代分析方法得到的图谱或数据.在一定程度上,化学指纹图谱可以表明中药的质量,进而保证中药的疗效[1].……

中国辽宁汉族人群D17S518基因座多态性分析

目的:调查D17S518基因座在辽宁汉族人群中的频率分布,并为法医学亲子鉴定和个人识别提供基础数据。方法:应用聚合酶链式反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显带技术,对中国辽宁省无血缘关系的汉族个体120例血液样本进行D17S518基因座分型。通过DNA序列分析确定其等位基因,并计算相关法医学参数。结果:在无血缘关系汉族个体120例中,检出D17S518基因座的5种等位基因及12种基因型。(1)根据DNA序列分析结果,将扩增片段长度为88bp、90bp、94 bp、98 bp、100 bp的5种等位基因分别命名为D17S518*15、D17S518*16、D17S518*18、D17S518*20和D17S518*21。(2)12种基因型及频率分别为:15/15型为12例(10%),16/16型为13例(10.7%),18/18型为3例(2.5%),15/16型为21例(17.5%),15/18型为23例(19.2%),15/20型为6例(5%),15/21型为2例(1.7%),16/18型为20例(16.7%),16/20型为8例(6.7%),16/21型为5例(4.2%),18/20型为4例(3.3%),18/21型为3例(2.5%)。(3)5种等位基因频率分别为:D17S518*15=0.317、D17S518*16=0.333、D17S518*18=0.233、D17S518*20=0.075、D17S518*21=0.042。(4)对D17S518基因座群体行数据分析,获得法医学应用参数:杂合度(H)为0.767,个人识别几率(DP)为0.872,偶合几率(Pm)为0.128,非父排除率(PE)为0.539,多态信息含量(PIC)为0.68。结论:D17S518基因座在中国辽宁省地区汉族群体中具有良好的多态性分布,有较高的遗传多态性,在法医学上具有较高的应用价值。

霍乱弧菌分子分型和溯源技术ISSR-PCR的改进

目的对简单序列重复区间聚合酶链反应(ISSR-PCR)进行改进和优化,以建立一种改进型霍乱弧菌分子分型和遗传溯源技术。方法通过设计、筛选优良扩增引物和优化反应体系对ISSR-PCR进行技术改进,并选择75株霍乱弧菌作为方法学的分型测试样品进行实验验证。结果经筛选以引物ISSR_GA5分型效果最佳。对ISSR-PCR实验条件进行优化,确定最佳反应体系:Mg2+浓度为2.0mmol/L,dNTPs浓度为0.3mmol/L、引物浓度为1.2μmol/L。采用改进型ISSR-PCR技术能正确区分霍乱弧菌菌株中的产毒株(流行株)和非产毒株(非流行株)、O1群/O139群和非O1/非O139群以及本地株和外地株。结论建立的改进型ISSR-PCR技术分型效率高,为我国卫生检疫和疾控部门开展霍乱等重要传染病的防控和疫情溯源提供了新的、简便实用的技术方法。