川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究

目的寻找川芎的高效分子标记。方法以四川崇州、都江堰、新都3个产地的川芎为材料,应用100条简单序列重复间区多态性(ISSR)引物、64对扩增片段长度多态性(AFLP)引物对30个川芎个体进行多态性筛选。结果筛选到简单序列重复间区多态性特异性引物共10条,扩增片段长度多态性特异性引物共6对;分别扩增出106和256条条带,多态条带百分率分别为22.64%和22.27%。平均标记指数AFLP的检测效率(1.78)明显高于ISSR(0.42)。两种标记基于遗传相似值聚类分析结果存在着一定的差异,但用Mantel测试对两种方法检测的遗传一致度进行相关性分析表明,它们之间存在着显著的相关性(r=0.6975,p=0.014)。结论川芎具有较低的遗传多样性,AFLP更有效于ISSR。

正交设计优选味连简单序列重复间扩增多太性反应体系的研究

目的优化味连简单序列重复间扩增多太性(Coptis chinensisFranch.ISSR)反应体系。方法利用正交实验设计,从Mg2+,dNTP,引物,BSA这4种因素3个水平进行优化。结果确立了适合黄连ISSR分析的反应体系,即在25μl反应体系中,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/LMg2+,200μmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,40 ng模板,1UTaqDNA聚合酶,BSA 1μg/μl。结论利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱。

石斛属植物遗传多样性的简单重复间系列分析

目的研究我国石斛属植物问的亲缘关系。方法从55个ISSR引物中筛选出14个多态性好的引物对石斛属（Dendrobium）植物基因组DNA进行简单重复问序列（ISSR）分析。利用POPGENE32软件计算ISSR扩增产物的Neig基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），标记系统的有效等位基因数（effective number of alleles，NE）。应用NTSYS（3．0）软件计算Neig遗传距离和遗传相似系数。按照非加权平均距离法（UPGMA）构建聚类关系图。结果14条引物共扩增出123条带，多态性带112条，约占总数的91．06％，平均每个引物扩增的DNA带数为8．79条。Neig基因多样性指数（H）为0．3519，Shannon信息指数（I）为0．5282，有效等位基因数（NE）为1．5945，种间的相似系数介于0．0909～0．6957，平均为0．3779。结论我国石斛品种的遗传基础比较丰富，ISSR分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统基本一致．

鼠曲草简单重复序列间扩增反应体系的建立及优化

目的通过建立并优化鼠曲草简单重复序列间扩增(ISSR-PCR)反应体系,为鼠曲草后续遗传多样性研究提供实验依据。方法本研究首先采用单因素实验法和全面实验法优化鼠曲草ISSR-PCR反应体系,然后在最适体系下,分步进行引物及其退火温度的筛选,最后验证该体系的可行性。结果ISSR-PCR最适反应体系包括10μl Premix Taq DNA聚合酶、0.3μmol/L引物、10 ng DNA模板、灭菌水加至20μl;从100条通用引物中最终筛选出10条引物;验证结果表明该体系稳定性高、重复性好,且选定引物多态性好。结论本研究首次建立了鼠曲草ISSR-PCR扩增体系,并筛选出合适的引物,为鼠曲草后续遗传多样性研究夯实了基础。

苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR特异片段克隆和序列分析

利用ISSR分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育"三系"mtDNA进行多态性分析;在选用的38个IS-SR引物中,有6个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定,结果表明:片段21-MS全长956bp,包含一个525bp的完整编码区,共编码174个氨基酸。片段31-M/R全长778bp,包含一个404bp的不完整编码区,共编码134个氨基酸;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71～76和73～77的同源性。

息半夏种质资源遗传多样性的ISSR分析

对信阳息县道地药材息半夏种质资源遗传多样性进行研究,利用ISSR技术对24份半夏进行扩增。共挑选出了8条扩增条带清晰的引物,并检测到117条明显的条带,多态性条带为110条,平均多态性信息指数(PIC)为0.8508,平均观测等位基因数(Na)为1.9279,平均有效等位基因数(Ne)为1.4811,平均Nei氏基因多样性(H)为0.2927,平均香农信息指数(I)为0.4481。利用UPGMA方法进行聚类分析,24份半夏在遗传相似系数0.5901处被分为3个类群。结果表明,24份半夏种质资源具有较高的遗传多样性。

白及种质资源遗传多样性分析

【目的】采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系,为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。【方法】从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离,用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。【结果】从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物,共扩增出188个条带,平均每个引物扩增出17.09个条带,其中多态性位点174个,占总扩增片段的92.20%;从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合,共扩增出216个条带,平均每个引物扩增出19.64个条带,其中多态性位点202个,占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现:四川白及种源的遗传多样性水平最高,贵州最低;非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示:聚为一类的白及种源大多来自同一省份,云南省与四川省白及种源的遗传距离较近,浙江省和贵州省白及种源的遗传距离较近,说明遗传距离与地理距离存在一定的重合,但并不呈正相关。【结论】本研究所选白及种源间具有较高的遗传多样性,ISSR和SRAP标记技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系。

山桐子性别分子标记的通用性验证

采用已知性别的120份山桐子(Idesia polycarpa Maxim.)样品,检验了2个已报道UBC841和STZ分子标记在山桐子性别鉴定中的通用性。同时,分析了大量简单重复序列间区扩增多态性(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)标记在山桐子雌雄株中的多态性。结果表明,UBC841标记在24份山桐子样品中可检测到多态性条带,但未检测到雌雄性别特异性条带;STZ标记可在部分样本中扩增出目的条带,但未表现出雌雄株性别特异性;说明这2组标记均未表现出良好的通用性,雌雄性别鉴别准确率较低。此外,筛选了26条ISSR引物和780对SRAP引物组,也未能获得雌雄性别特异标记,说明采用通用型分子标记ISSR和SRAP在山桐子中较难筛选到稳定、可靠的性别特异的标记。

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。

桑树二倍体及其同源四倍体遗传差异的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术,研究了农桑8号、湖桑199号、湖桑197号、育71-1、育2号、湖桑32号等6份二倍体品种和经秋水仙碱化学诱变得到的同源四倍体之间的DNA遗传差异。结果表明:桑树不同材料二倍体及其同源四倍体之间的ISSR多态性有明显差异;农桑8号、湖桑197号、育2号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,无差异;湖桑32号二倍体及其同源四倍体的ISSR多态性最高,达到了23.53%。说明不同桑树材料经秋水仙碱诱变后产生的遗传差异较大。

ISSR方法在蓖麻蚕品种遗传多样性研究中的应用

采用ISSR技术对8个蓖麻蚕品种进行了基因组DNA多态性研究,并分析了其相互间的遗传差异.结果表明,所采用的19个ISSR引物中,有9个引物在供试的8个蓖麻蚕品种中都有扩增产物并能够很好重复,其中二碱基重复序列引物扩增效果要比三碱基和四碱基重复序列高,说明在蓖麻蚕基因组中二碱基重复序列的丰度可能比三碱基和四碱基重复序列的丰度高.这9个引物在8个蓖麻蚕品种中共获得ISSR标记76个,其中29个标记在品种间表现多态性.根据试验结果,用Nei的方法计算了蓖麻蚕品种间的遗传距离为0.068 1～0.270 3.根据各品种间的遗传距离,用UPGMA聚类分析软件绘制了聚类图.

七筋菇植物ISSR-PCR反应体系研究

为建立适宜于七筋菇Cliatonia udensis Trautv．et Mey．ISSR—PCR分析的扩增体系，确定引物适宜的退火温度，利用正交试验设计，从Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶单位、引物浓度4种因素4个水平，对七筋菇ISSR—PCR反应体系进行优化。结果表明，根据Tm-5℃±5℃设定引物的退火温度梯度，确定出不同引物的最适退火温度。对引物873来说，其最适退火温度为53℃。按照正交试验设计，测试不同引物各因子之间在不同水平的组合情况，确定不同引物的最佳组合体系。引物897在第10组合反应最佳即3．0mmd·L^-1Mg^2＋；0．2mmol·L^-1d NTP；0．1μL Taq DNA聚合酶；0．2μmol·L^-1引物浓度。确定10μL的反应体系中，Mg^2＋为2．5—3．0mmol·L^-1，dNTP为0．15～0．20mmol·L^-1，引物浓度为0．20—0．25μmol·L^-1，Taq DNA聚合酶为0．1μL，模板DNA用量为50ng。适宜的退火温度为48—62℃。

柞蚕品种资源遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对66份柞蚕（Antheraea pernyi）品种材料进行了遗传多样性研究。筛出的11个ISSR引物共扩增出118条带,其中多态性条带为107条,多态性比率为90.67%,遗传相似性系数范围在0.390~0.805之间。根据ISSR标记的结果,采用UPGMA聚类分析方法,将供试材料分为4大类群。研究结果表明,柞蚕品种的聚类与体色并没有一定的相关性。

38个紫薇品种亲缘关系的ISSR分析

紫薇是世界著名的夏季观赏花木之一,品种繁多、来源复杂,造成了紫薇品种在分类、鉴定上的困难。为探讨简单重复序列间扩增多态性(ISSR)分子标记方法在紫薇品种分类上的可行性,对引自美国的30个紫薇品种和中国的8个栽培品种进行ISSR亲缘关系分析。10条扩增带型清晰且重复性好的引物共获得81个位点,其中70条呈多态性,多态性百分比(PPB)为86.42%。38个紫薇品种的遗传相似性系数介于0.543 2～0.988 7,平均值为0.788 2。在遗传相似性系数0.736处,聚类结果(unweighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)显示,38个紫薇品种分为3个类群,在0.760处可进一步分为7个亚类群,表明ISSR标记技术能从分子水平上较为准确地体现紫薇品种间的亲缘关系。

RAPD and ISSR Markers of Fertility Restoring Gene for Aegilops kotschyi Cytoplasmic Male Sterility in Wheat

LK783 was found to be a good fertility restorer for K-type male sterility of wheat (Triticum aestivum L.). RAPD and ISSR (inter-simple sequence repeat polymorphism) markers were employed to map the major restoring gene in LK783. Maintainer and restorer DNA pools were established using the extreme sterile and fertile plants among KJ5418A//911289/LK783 F 1 population, respectively. Four hundred and eighteen RAPD primers and 33 ISSR primers were used for screening polymorphisms between the two pools, and amplification bands using a RAPD primer of OPK18 and an ISSR primer of UBC-845 were found polymorphic between the two pools. Linkage analysis showed that OPK18 450 and UBC-845 800 were linked to the restoring gene in LK783. The distance between the restoring gene and OPK18 450 was (15.07±6.28) cM (centiMorgan), with the distance between the restoring gene and UBC-845 800 being (8.20±4.85) cM. The marker of UBC-845 800 was located on chromosome 1BS by amplifying nulli-tetrasomics and 1B ditelosomics of Chinese Spring with the primer of UBC-845, indicating that the restoring gene in LK783 was located on 1BS. The breeding for new fertility restorer lines of K-type cytoplasmic male sterility of wheat would be facilitated by using the two markers.

果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以果梅品种桃梅为试材，通过单因子试验分别研究了DNA模板浓度、引物浓度、Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度及循环数等对果梅ISSR-PCR反应的影响．建立了果梅ISSR-PCR的最佳反应体系：20μL反应体系中含10×buffer2μL，2．5mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTPs，0．32μmol／L引物，20～80ng模板DNA，1UTaq DNA聚合酶．利用优化的反应体系，对19个果梅品种进行体系稳定性检测，结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好．

ISSR和ITS分子标记在黑龙江省野生黑木耳遗传多样性上的应用

利用ISSR和ITS标记对黑龙江省采集的33株野生黑木耳菌株和8个黑龙江省常见栽培菌株进行遗传多样性分析,利用PCR-ISSR体系,选出9个ISSR引物对菌株DNA进行扩增,通过聚类分析对遗传多样性进行分析。结果表明,9个ISSR引物扩增条带103条条带,其中多态性条带95条,多态性比率为92.2%,平均每对引物扩增出条带11.4条,平均每对引物扩增出多态性条带10.6条,平均多态性比例为91.7%。多态性信息含量（PIC）变化在0.063~0.924之间。通过ITS序列对黑木耳菌株进行亲缘关系分析,利用软件ClustalX 1.83和MAGA 4.1进行系统发育分析分析。结果表明,黑木耳ITS1、5.8S、ITS2三个区信息为点比例达到52.1%,遗传位点丰富。两种标记方法均显示黑木耳野生菌株间遗传多样性优于栽培菌株。ISSR和ITS两种方法联合使用可得到较好结果。

香花油茶分子分类与鉴定

为给香花油茶归类地位的确认提供一定的分子依据,明确香花油茶的分类地位,通过ISSR标记技术,探究香花油茶与山茶属中形态特征相似的其它5个种之间的亲缘关系。结果表明:香花油茶与供试山茶属5个种(小果油茶、南荣油茶、窄叶短柱茶、普通油茶、攸县油茶)遗传距离较远,各自聚类显著,因此香花油茶不属于参试的5个山茶物种;其中与窄叶短柱茶的亲缘关系为近,遗传距离偏小,但遗传距离也远大于种内差异,且形态特征与窄叶短柱茶最为接近,推测香花油茶可能是山茶属短柱茶组1个新物种。

24个白桑(Morus alba L．)地方品种的遗传多样性分析

采用ISSR分子标记技术对山东、河北地区的24个白桑（Morus alba L．）地方品种资源进行了遗传多态性分析。筛选的13条ISSR引物共扩增86条扩增带，其中多态性条带63条，多态性比率为73．25％，ISSR标记遗传相似系数范围在0．6706～0．9529。通过类平均聚类（UPGMA）法分析，24份材料聚分为2大类。

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心（Brassica campestris L．ssp．Chinensis Var．utilis Tssen．et Lee．）为材料，对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨，确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数：在25pL反应体系中含10×buffer 2．5μL，2．0mmol／LMg^2＋，0．5U Taq DNA聚合酶，0．2mmol／LdNTPs，0．5μmol／L引物，30ng模板DNA．PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性1min，49．7～56℃退火（退火温度随引物不同而定）1min，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸5min．