共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

简并寡核苷酸引物PCR技术的建立及其检测灵敏度分析

目的建立基于简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed-PCR,DOP-PCR)的全基因组检测体系,并对其可靠性、灵敏度进行研究。方法通过荧光标记STR复合扩增毛细管电泳检测系统,对DOP-PCR扩增产物进行检测,获得DOP-PCR检测体系的灵敏度、可靠性。结果成功建立了可靠的DOP-PCR检测体系,经过DOP-PCR预处理再进行STR分型检验,其检测灵敏度可达到5个细胞量(相当于30 pg)。结论本研究建立的DOP-PCR技术可靠且可提高法医学微量检材的检测灵敏度。

简并寡核苷酸引物PCR扩增单细胞基因组的影响因素研究

[目的]研究影响简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)扩增单细胞全基因组的因素。[方法]以单个人外周血淋巴细胞为材料,进行DOP-PCR,研究新鲜细胞与冷藏细胞及采用新鲜和冻存的细胞裂解物为模板对扩增产物的均匀性及特异性的影响。[结果]以新鲜的淋巴细胞为模板与以冷藏的淋巴细胞为模板相比,扩增产物的均匀性相当,特异性上新鲜细胞较好。细胞裂解后立即进行扩增的效果在产物的均匀性及特异性方面均明显优于冻存的细胞裂解物。[结论]对单细胞应用DOP-PCR方法进行全基因组扩增时,应尽量选取新鲜细胞进行裂解,裂解后避免冻存以保证扩增的均匀性及特异性。

沙粒病毒属四步法一致-简并杂合寡核苷酸引物实时荧光PCR检测体系的建立

目的建立沙粒病毒属四步法一致-简并杂合寡核苷酸引物（CODEHOP）实时荧光PCR（Real-time PCR）检测体系。方法设计1对沙粒病毒属的一致-简并引物,分析Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线,根据引物二聚体（PDs）和扩增产物的熔解温度（Tm）值,在通用的三步法延伸步骤之后,增加5 s的恒温荧光检测步骤,在PDs和特异性扩增产物的熔解温度之间进行荧光检测温度的优化,建立四步法CODEHOP Real-time PCR方法,评价其灵敏度、特异性和重复性。结果 PDs的Tm值为75.32-76.86℃,特异性扩增产物的Tm值为86.84℃,增加一步温度为84℃,荧光检测步骤可有效去除PDs对检测结果的影响,该方法特异性为100%,病毒RNA检测灵敏度为59.6 pg,重复性良好,变异系数〈5%,12份鼠肺盲样的检测结果符合预期。结论建立的沙粒病毒四步法CODEHOP Real-time PCR检测方法敏感、特异,可用于鼠类沙粒病毒感染检测。

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR(CODEHOP-PCR)在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。

引物延伸预扩增结合简并引物PCR在单细胞比较基因组杂交分析染色体异常中的应用

目的 建立一种可信的单细胞全基因组扩增（whole genome amplification.WGA）技术,结合比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）分析单细胞的染色体拷贝数变化,探讨其在胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）中的应用前景.方法 采用引物延伸预扩增结合简并核苷酸引物PCR（primer extension preamplification with degenerate oligonucleotide primed-PCR,PEP-DOP-PCR）的方法,扩增12个已知核型的单细胞标本（包括5个绒毛标本、4个干细胞标本和3个淋巴细胞标本）和4个经PGD检测发现染色体异常的单卵裂球标本,将扩增产物标记红色荧光染料后,与标记绿色荧光染料的正常DNA等量混匀,与正常中期分裂相进行比较基因组杂交分析.同时,应用单纯的简并寡核苷酸引物-PCR（DOP-PCR）扩增10个单细胞DNA,标记后进行CGH分析.比较两种单细胞全基因组扩增方法的扩增效率及随后用于CGH分析染色体拷贝数时的准确性.结果 所有的单细胞采用PEP-DOP-PCR扩增时,均能获得稳定均匀的PCR产物,片段大小范围在100～1000 bp之间,集中分布于400 bp左右的区域,CGH分析结果显示染色体拷贝数变化与其它技术检测的结果一致.而10个单纯的DOP-PCR扩增只有6个标本成功,扩增产物进行CGH分析时,杂交信号不均匀,有2个显示与其它技术分析的结果不一致.结论 PEP-DOP-PCR技术能有效地扩增单细胞的全基因组DNA,其扩增产物可应用CGH技术成功检测单个细胞的染色体拷贝数变化,而单纯的DOP-PCR技术易于出现扩增失败、扩增产物杂交后信号不均一的缺点.PEP-DOP-PCR全基因组扩增结合CGH技术在胚胎植入前遗传学诊断中有良好的应用前景.

STR滑脱模型的构建及其影响因素

目的探索建立体外STR滑脱模型,研究STR滑脱产生的影响因素,探讨STR的发生机制。方法首先通过全基因组扩增技术—简并寡核苷酸引物PCR(Degenerateoligonucleotide-primedPCR,DOP)对模板DNA样本进行扩增放大,然后以其产物作为后续STR分析的模板,对以上实验过程中的一系列实验条件进行控制,观察滑脱现象的产生情况。结果初步建立了STR的滑脱模型,观察到了STR滑脱现象的发生。结论STR的发生是一系列综合因素作用的结果,DNA模板用量、MgCl2的浓度、DNA聚合酶的性质、样本以及STR的基序组成等因素均可能参与了这一过程。

硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1-copia类逆转座子的克隆及分析

利用Tvl—copia类逆转座子逆转录酶（RT）的保守区域设计引物，优化了扩增条件后利用RT—PCR从白桦愈伤组织中得到了1条逆转录酶序列。利用硝普钠（SNP）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后分别扩增克隆了11条和9条逆转录酶序列。这2l条逆转录酶序列（命名Bprtl-21）变化范围为205—290bp，一致性为71．93％，异质性为1．1％。50．9％，翻译成氨基酸的异质性为0～57．1％。经SNP和MeJA处理的样品中，获得的逆转录酶序列基本是分别聚类．初步证明不同的Tvl-copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。分析所获得的21逆转录酶序列和苹果中19务逆转录转座子序列（DQ410748-DQ410766）进化关系发现．逆转录酶基本各自聚类。但是Bprt9、Bprtll和OQ4m750进化关系比较接近，Bprt15、Bprt19、DQ410751和DQ410753聚为一类，证明逆转座子存在水平传递。

Flow-rSSO及PCR-SBT方法检测KIR基因有无的对比研究

目的研究流式磁珠序列特异性寡核苷酸探针(Flow-rSSO)杂交及测序分型(PCR-SBT)方法鉴定KIR基因有无的一致性。方法对131例汉族人群的DNA标本采用Flow-rSSO方法鉴定全部16种KIR基因的有无,并采用本实验室建立的PCR-SBT方法对14种功能性KIR基因进行高分辨水平基因检测;分析Flow-rSSO及PCR-SBT两种方法鉴定14种功能性KIR基因有无的一致性。对初检结果不一致的标本,采用同一厂家、不同批号的Flow-rSSO试剂盒进行复检,并采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法进行检测。结果131例标本中有129例完全一致,2例不一致,占1.5%(2/131)。不一致的两例标本,1例标本3DL1基因、另1例标本2DS3及2DS5基因,其Flow-rSSO初检结果均为阴性,而PCR-SBT结果均为阳性。更换新的批号Flow-rSSO试剂盒复检,两例标本的结果均为阳性;采用PCR-SSP方法检测的结果亦为阳性。结论经Flow-rSSO试剂盒检测KIR基因有无,出现2例标本初检结果错误,提示检测KIR基因有无时,试剂的质控工作至关重要。

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL^2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。

基于CODEHOP的欧李钙调蛋白基因片段的克隆

为克隆欧李钙调蛋白基因序列,本研究采用CODEHOP方法设计了一对简并引物,F1:5'-GGCTGACCAACTGACCga(c/t)ga(c/t)ca(a/g)at-3';F2:5'-CACGTCAGCCTCTCTGatcat(c/t)tc(a/g)tc-3';并采用传统简并引物设计方法设计了简并引物N1:5’-AAATGGC(A/C/G)GATCAGCT(A/C/T)AC-3’;N2:5:’-CACTT(A/G)GCCATCATGAC(C/T)TT-3’.从欧李的幼苗组织中成功克隆出了钙调蛋白基因片段,并第一次完成了对该序列的测序.通过利用NCBI的Blast进行分析等方法证实了该序列与其他植物的钙调蛋白序列具有高度的同源性,该序列与梅花、桃、甜樱桃的钙调蛋白序列同源性都在90%以上.研究证明CODEHOP软件相比传统的设计简并引物的方法具有可信性和高效性,并且钙调蛋白目的基因的成功克隆对钙调蛋白以及欧李高钙特性的研究提供了基础数据.

蚊类携带甲病毒属病毒CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立蚊类感染甲病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据甲病毒属病毒非结构蛋白氨基酸序列，设计1对CODEHOP引物，建立甲病毒属病毒一步RT—PCR检测方法，分析该引物在对不同种甲病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小；通过检测甲病毒属基孔肯亚病毒JC2012株，评价该方法的特异性和灵敏度：对JC2012扩增产物进行Blast同源性比对。结果建立的CODEHOPRT-PCR方法可特异性扩增基孔肯亚病毒核酸，目的片段的大小与预期结果相符，核酸的最小检出量为56．7pg。经Blast比对，结果与Genebank公布的CHIKVJC2012序列结果一致。同时从GenBank获得的22种甲病毒均存在CODEHOP引物结合位点．扩增产物大小在510～550bp之间。结论建立的甲病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异，可用于蚊类甲病毒感染检测。

两种全基因组扩增技术对单根毛发DNA检验效能的研究

目的研究简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)对单根毛发检验的法医学价值。方法以三种方法对单根毛发样本进行STR分型,第一种方法直接对提取DNA用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,第二种和第三种方法是先对提取的DNA样本分别进行DOP-PCR和PEP-PCR扩增处理,然后对其产物用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,对两种方法的效能进行比较评价。结果 DOP-PCR和PEP-PCR技术增加了单根毛发STR分型的准确率和信息量。结论 DOP-PCR和PEP-PCR技术对单根自然脱落毛发的检验具有实用价值。

两种不同的KIR基因分型方法的对比研究

目的探讨常用的序列特异性引物-PCR（PCR—SSP）及流式序列特异性寡核苷酸探针（Flow-rSSO）杂交方法在杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）框架基因分型结果中的符合率和准确性。方法随机选择2011年6月77例深圳造血干细胞捐献者的外周血样，分别用PCR-ssp及Flow-rSSO商品化试剂盒进行KIR框架基因定型，分别通过凝胶电泳图及HLA Fusion 2．0 Research软件分析法，分析结果的一致性。对初检结果不一致的样本，采用同一厂家、不同批号的商品化试剂盒进行复检，并采用美国国立卫生研究院癌症研究所KIR PCR-SSP方法进行检测。结果77例样本中，75例完全一致，另2例（2．6％）KIR 2DL2的结果不一致，PCR—SSP方法对KIR 2DL2的初检、复检检测结果均为阴性，但用Flow-rSSO Lot#004批号试剂盒检测结果为阳性。更换新的Flow—rSSO Lot#005批号试剂盒复检，结果与PCR—SSP方法的检测结果相一致。结论为保证KIR基因分型的准确性，开展KIR基因分型的室内、室间质控工作至关重要。

应用CODEHOP PCR快速检测水体中致病性弧菌

目的建立可以快速检测不同致病性弧菌的CODEHOP PCR方法。方法以致病性弧菌共有的DNA旋转酶B亚单位氨基酸为目标,采用CODEHOP程序,设计一对引物,建立弧菌CODEHOP PCR检测方法,以8种不同致病性弧菌菌株及其他菌株为模板,评价方法的灵敏度、特异性,并对64份入境船舶压舱水进行致病弧菌检测。结果该方法特异性好,8种致病性弧菌标准菌株均获得特异性扩增条带,检测灵敏度可以达到3×103CFU/ml,从64份入境压舱水中检测到14份阳性样品,PCR产物经TA克隆后,测序分析确定为4种不同致病性弧菌。结论本研究所建立的方法可用于致病性弧菌的快速检测与种类鉴定。

实验模型下两种全基因组扩增技术对指纹DNA检验的效能

目的对简并寡核苷酸引物PCR(Begenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(Primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)用于指纹检材DNA检验的价值进行研究。方法建立2种指纹检材DNA模型,分别用普通PCR、DOP技术和PEP技术三种方法对指纹DNA样本进行STR分型,对三种方法的效能进行比较评价。结果实验模型1条件下,三种方法均不能获得满意分型结果;模型2条件下,DOP和PEP两种方法可以增加STR分型的成功率和信息量。结论 DOP和PEP技术必须结合高效的DNA提取技术才能最大程度发挥其检验效能。