一个成株抗白粉病小麦-簇毛麦T2DS·2V#6L易位系的选育

白粉病是威胁全球小麦生产的一种严重病害,从小麦野生近缘种发掘成株抗白粉病基因资源对培育持久抗性品种十分重要。本研究从硬粒小麦-簇毛麦01I139(V#6)双二倍体AABBVV-3与普通小麦NAU0686杂交、回交的后代中鉴定到一个小麦-簇毛麦2V#6(2D)异代换系11-2V-1,利用11-2V-1在染色体2V和2D之间产生重组,将11-2V-1与高感白粉病普通小麦NAU0686杂交,F_(1)自交。利用GISH/FISH和分子标记对F_(2)世代131个单株进行分子细胞学鉴定,获得了小麦-簇毛麦T2DS·2V#6L易位系11-2V-2、2V#6S端体系11-2V-3和2V#6L端体系11-2V-4新种质。白粉病抗性鉴定发现,所有F_(2)单株苗期均高感小麦白粉菌生理小种E09,但成株期含有2V#6和2V#6L染色体臂的所有单株均表现高抗(IT=1~2),而仅含有2V#6S染色体臂或无外源染色体的单株均高感白粉病(IT=7~9),表明簇毛麦01I139的2V#6L染色体臂上携带成株抗白粉病基因,该基因可能与小麦-簇毛麦T2BS·2V#5L易位系携带的Pm62是等位基因。遗传效应分析表明,T2DS·2V#6L易位染色体在小麦背景传递正常,对主要农艺性状没有显著的负向影响,对穗长、每穗粒数和单株粒重还表现出一定程度的正向效应。因此,本研究创制的成株抗白粉病T2DS·2V#6L易位系11-2V-2为小麦抗白粉病育种提供了新抗源,也为后续簇毛麦2VL上优异基因遗传定位和图位克隆奠定了基础。

一年生簇毛麦基因资源挖掘与利用研究进展

一年生簇毛麦(Dasypyrum villosum (L.) Candargy)是普通小麦野生近缘种之一,也是近年来应用较广泛的小麦遗传资源。簇毛麦在长期进化过程中,形成了许多可用于小麦遗传改良的重要农艺性状,包括对非生物和生物胁迫的抗性、优良品质等。本文简述了簇毛麦与普通小麦的同源关系、与小麦属杂交亲和性,以及将簇毛麦染色体、片段、基因导入普通小麦的有效方法,综述了簇毛麦对白粉病、纹枯病、条锈病、眼斑病、黄花叶病、全蚀病、胞囊线虫病等病害的抗性基因和对应的染色体,簇毛麦品质基因(如:高赖氨酸含量和多态性贮藏蛋白等)和簇毛麦耐旱、光周期等其他基因。介绍了簇毛麦抗白粉病基因Pm21和PmV在小麦改良和育种中的应用及其巨大价值,展望了簇毛麦后续研究前景和可能存在的问题。本综述对挖掘与利用簇毛麦有益基因、拓宽小麦遗传资源、加快小麦遗传改良进程以及重要基因功能研究均具有参考价值。

InDel分子标记WC656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5VS纯合易位中的应用

簇毛麦是小麦品种改良重要的遗传资源,其5VS上含有硬度基因Dina/Dinb、抗白粉病基因Pm55和抗条锈病基因Yr5V,创制普通小麦-簇毛麦5VS易位系新种质,对于高效利用5VS上的有益基因进行小麦品种遗传改良具有重要意义。为了便于鉴别普通小麦-簇毛麦5VS纯合易位,本研究以mInDel软件分析普通小麦中国春基因组序列,开发了小麦第5同源群短臂的InDel特异分子标记WC656,对小麦品种以及普通小麦-簇毛麦5VS.5AL和5VS.5DL易位系及其衍生后代进行PCR扩增,根据扩增片段大小来区分5AS、5BS、5DS染色体臂以及5VS易位系。结果表明,在21个普通小麦品种、小麦-簇毛麦5VS回交F 2代中杂合易位单株,均扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)、422 bp(5DS)3条带。在T5VS.5AL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出471 bp(5BS)、422 bp(5DS)2条带,379 bp(5AS)条带缺失。T5VS.5DL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)2条带,422 bp(5DS)条带缺失。WC656鉴别的5VS纯合易位结果与顺序FISH-GISH分析结果一致。T5VS.5AL、T5VS.5DL具有抗白粉病、籽粒硬度指数低等优良特性。因此,利用InDel分子标记WC656可以鉴别普通小麦-簇毛麦T5VS.5AL、T5VS.5DL衍生后代中的纯合易位,PCR扩增实验操作相对简便,可以为分子标记辅助选育携有5VS纯合易位的软质弱筋小麦提供帮助。

簇毛麦3V染色体短臂特异分子标记的开发与应用

普通小麦野生近缘物种簇毛麦(Haynaldia villosa L.2 n=14,VV)3V染色体短臂(3VS)携带抗小麦条锈病基因。开发高密度的3VS特异标记是准确鉴定和追踪3VS、推进抗病基因转移和利用的重要基础。为了开发更多的均匀分布于3VS染色体臂不同区段的分子标记,本研究利用簇毛麦和小麦品种中国春参考基因组序列与基因注释信息,通过比较3VS与3AS、3BS、3DS同源基因序列内含子序列差异,选择同一内含子长度差异大于10%的区域开发了104个跨越内含子(intron targeting,IT)的分子标记,在簇毛麦、簇毛麦-硬粒小麦双二倍体、硬粒小麦中引1286、中国春、普通小麦-簇毛麦二体异附加系DA1V-DA7V、小麦-簇毛麦T3VS·3DL易位系中进行扩增,筛选出3VS特异、扩增条带清晰且稳定性好的IT分子标记43个。为了验证上述标记的有效性,选择位于3VS不同区段的12个标记对[DS3V(3D)×中国春ph1b]的F_(3)群体中的148个ph1b纯合的单株进行分析,共筛选得到6种类型涉及3VS的结构变异体。进一步利用GISH/FISH技术对上述材料进行鉴定,结果与分子标记结果相吻合,证明利用外源染色体特异分子标记可有效筛选涉及外源染色体结构变异体。

二套小麦-簇毛麦染色体附加系苗期耐盐性及籽粒硒和叶酸的含量

簇毛麦(Dasypyrum villosum)作为小麦的近缘种,具有许多优良基因,是改善小麦耐盐性和提高小麦营养品质的理想材料。以小麦-簇毛麦#2和小麦-簇毛麦#3二体附加系为材料,进行耐盐性鉴定及籽粒中硒和叶酸含量的测定。发现小麦-簇毛麦#2附加系和#3附加系在盐胁迫下的萌发率分别为16.67%-43.33%、26.67%-70.00%,均高于对照中国春(6.65%);盐胁迫下附加系DA3V#3、DA7V#3、DA2V#3和DA5V#2的萌发率分别为70.00%、56.67%、53.33%和43.33%;盐胁迫下附加系的生长正常,株高和根长均大于对照中国春,其中DA4V#2和DA2V#3的株高分别达到15.2和16.1 cm,DA2V#3根长为3.4 cm;在14个附加系和对照中,DA2V#2和DA2V#3籽粒硒含量最高,分别为8.47和7.60μg/g。小麦-簇毛麦#2附加系和#3附加系籽粒中叶酸含量为9.00-26.10μg/100 g,大多数附加系高于对照中国春(10.98μg/100 g),其中,附加系DA4V#2和DA6V#2与对照差异达极显著水平,DA6V#2比对照增加2.4倍。簇毛麦2V#3、3V#3和5V#2染色体可能存在耐盐相关基因,2V染色体可能存在富硒相关基因,6V#2染色体可能携带籽粒叶酸合成的相关基因。

簇毛麦2V染色体特异分子标记开发

簇毛麦是小麦遗传改良的重要基因资源之一,其2V染色体上携有抗白粉病、护颖颖脊刚毛、光周期响应、长穗多粒等许多普通小麦所不具备的优良基因,但缺乏足够的分子标记,不能准确鉴定导入小麦的2V染色质。为了开发2V染色体上特异分子标记,本研究设计了2套引物,一套是基于普通小麦第2群染色体不同区段表达序列标签设计的序列标记位点引物30对,另一套是基于小麦2D、黑麦2R测序结果同源比对的差异设计的内含子定位引物296对,分别筛选出2个和33个2V染色体特异分子标记,占总引物数6.7%和11.1%,说明基于新一代高通量测序技术设计内含子定位引物是一种开发染色体特异性标记的高效方法。研究结果进一步发现,大多数位于小麦2D染色体上的基因可以分别对应2V染色体相同区段上的基因,但也有例外,说明簇毛麦2V染色体与普通小麦2D染色体之间存在复杂的共线性关系。本研究共开发出35个标记,并对其可靠性进行了验证,其中lfz8187_(-1100)定位于2VS FL0.68-1.00,lfz8387_(-280)、lfz8462_(-760)和lfz8470_(-200)定位于2VS FL0.00-0.26,其余31个标记定位于2VL。这些分子标记为鉴定2V染色体结构变异提供了有效工具,也为鉴定导入普通小麦的2V染色体携带的有益基因提供了技术支撑。

簇毛麦（Haynaldia Villosa）的原生质体培养

簇毛麦的幼胚在含有９μｍｏｌ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＢ固体培养基上诱导产生愈伤组织，在相同的培养基上继代培养两个月后出现淡黄色的致密瘤状愈伤组织．在继代培养过程中，愈伤组织的分化能力丧失较快．继代培养一年左右，改变培养条件，可得到颗粒状及粉粒状愈伤组织．分别用这两种类型的愈伤组织建立悬浮培养细胞系．愈伤组织的形态结构与悬浮系的建立及原生质体培养密切相关．来源于颗粒悬浮系的细胞团块产生的原生质体分裂后可产生体细胞胚，而用粉粒悬浮系分离的原生质体不能持续分裂．

簇毛麦染色体特异分子标记的筛选及应用

簇毛麦是小麦的一个野生近缘种,抗病性和抗逆性强,蛋白质和赖氨酸含量高,是小麦遗传改良的重要基因源。为定位、转移和利用簇毛麦有益基因,通过花粉辐射,获得了一批涉及簇毛麦不同染色体且不同区段的结构变异体。为了鉴定该批材料中的簇毛麦染色体身份,选用小麦EST-STS引物和小麦、大麦及黑麦SSR引物共1576对,其中755对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及一套簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析,Xbarc210_(-220)等2个标记可追踪簇毛麦1V染色体,Xcinau186_(-600)等14个标记可追踪簇毛麦2V染色体,Xcinau 200_(-245)等8个标记可追踪簇毛麦3V染色体,Xcinau 206_(-400)等8个标记可追踪簇毛麦4V染色体,Xcinau 211_(-700)等41个标记可追踪簇毛麦5V染色体,Xcinau 250_(-120)等2个标记可追踪簇毛麦6V染色体,Xcinau 255_(-700)等14个标记可追踪簇毛麦7V染色体。利用这些簇毛麦染色体特异分子标记鉴定辐射诱导材料的回交后代,有70个结构变异体的簇毛麦身份得到确定,表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。

普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^(#1)染色体特异分子标记的筛选

为筛选普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体特异分子标记,根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物,对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析。在104对STS引物中,有53对在对照普通小麦中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。利用普通小麦-黑麦1R^7R二体异附加系筛选出5对黑麦1R染色体特异标记,分别是CINAU 19-500、CINAU20-950、CINAU21-1500、CINAU22-310和CINAU23-2000;利用普通小麦-簇毛麦1V^7V二体异附加系筛选出5对簇毛麦1V染色体特异标记,分别是CINAU23-1700、CINAU24-1050、CINAU25-1650、CINAU26-500和CINAU27-620;利用鹅观草二体异附加系DA1Rk#1、异代换系DS1Rk#1(1A)、端体系DA1Rk#1L、易位系T1Rk#1S.W、长臂缺失系Del1Rk#1L筛选出5对鹅观草1Rk#1特异标记,分别是CINAU27-960、CINAU28-1360、CINAU29-480、CINAU30-560和CINAU31-520。研究表明,可以利用普通小麦的EST序列设计PCR引物,转化成STS标记,筛选普通小麦近缘物种黑麦、簇毛麦及鹅观草等染色体特异的分子标记,快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体或染色体片段,为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供新的工具。

普通小麦与华山新麦草、簇毛麦杂交后代染色体形态观察

对普通小麦(Tritcium aestivum)与华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)杂交后代H9802-6、普通小麦与簇毛麦(Haynaldia villosa)杂交后代V9910-15-4花粉的减数分裂进行了细胞学观察。结果表明:H9802-6出现了异代换系和异附加系,因此该材料还不是很稳定;V9910-15-4后代个体中染色体数目、染色体构型多样复杂,染色体联会过程中出现了环状联会、顶端联会、单价体不联会等异常情况,其杂交后代的稳定及利用较困难。

用分子原位杂交（GISH）鉴定小麦－簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系

用生物素标记的簇毛麦（Ｈａｙｎａｌｄｉａｖｉｌｌｏｓａ）染色体组ＤＮＡ（ｔｏｔａｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）作探针，以普通小麦染色体组ＤＮＡ作遮盖（用量１：２００左右），进行有丝分裂中期和减数分裂中期Ｉ染色体的分子原位杂交（ＧＩＳＨ），经抗生物素蛋白－辣根过氧化物酶复合物（ｂｉｏ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）和联苯胺四盐酸（ＤＡＢ）检测显色后，小麦－簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系中的簇毛麦染色体及染色体片段显棕色，与显浅蓝色的小麦染色体可明显区分。用ＧＩＳＨ不仅可以检测导入小麦中的簇毛麦染色质，而且可以清楚地显示出易位染色体断裂点的确切位置。将ＧＩＳＨ用于减数分裂期染色体配对分析，还可以清晰形象地显示出同源和非同源染色体之间的配对和分离情况。

利用离果山羊草3C染色体诱导簇毛麦4V染色体结构变异

通过普通小麦农林 2 6 离果山羊草 3C异附加系与普通小麦 簇毛麦 4V(4D)代换系杂交 ,杂交F1代与普通小麦回交 ,综合运用染色体构型分析、C 分带和荧光原位杂交等技术从BC1F2 、BC1F3 代中鉴定出涉及簇毛麦 4V染色体的易位系、端体、等臂染色体系等变异植株 ,表明离果山羊草 3C染色体可有效诱发簇毛麦 4V染色体结构变异 ,是创造小麦 簇毛麦

基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用

为定位、转移和利用簇毛麦有益基因,通过花粉辐射,获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份,根据水稻、小麦的EST序列合成了240对STS引物,其中34对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析,标记CINAU32-300可追踪簇毛麦1V染色体,标记CINAU33-280、CINAU34-510、CINAU35-1100、CINAU36-380和CINAU37-400可追踪簇毛麦2V染色体,标记CINAU38-250可追踪簇毛麦3V染色体,标记CINAU39-950和CINAU40-800可追踪簇毛麦4V染色体,标记CINAU41-745和CINAU42-1050可追踪簇毛麦5V染色体,标记CINAU44-765和CINAU45-495可追踪簇毛麦7V染色体。加上本室已开发的2个6V染色体特异标记,用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交后代,选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套1V至7V染色体系,同时有18条易位染色体的簇毛麦身份得到确定,表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。

利用小麦微卫星引物建立簇毛麦染色体组特异性标记

选位于普通小麦1A-7A、1B-7B、1D-7D染色体上的102对微卫星引物对多年生簇毛麦、二倍体簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体与后代和普通小麦中国春、R25、R111、MY11进行了PCR扩增,发现引物对Xgwm301可以在含簇毛麦染色体的材料中扩出一条长415bp的特异片段(命名为Xgwm301/415),而所有供试小麦均未扩出此片段。进而用一套中国春-二倍体簇毛麦附加系来进行扩增,发现1V-7V染色体均可以扩出该片段,说明该片段为簇毛麦1V-7V染色体所共有。因此,Xgwm301/415是簇毛麦染色体组上的一个特异片段,可以用来快速跟踪检测导入到普通小麦背景中的簇毛麦染色体。

簇毛麦1V染色体SSR标记的筛选

选用位于普通小麦 1A、1B、1D染色体上的 32对微卫星引物对普通小麦中国春、簇毛麦、6个中国春 簇毛麦二体附加系和 1个普通小麦 簇毛麦二体代换系进行SSR分析 ,发现引物Xgwm4 98在簇毛麦中扩增出 2条长分别为 110bp和190bp的片段 (即Xgwm4 98 110和Xgwm4 98 190 ) ,这两个片段仅在簇毛麦、中国春 簇毛麦 1Ha附加系中出现 ,其余 2Ha、4Ha、5Ha、6Ha、7Ha附加系、3V代换系和中国春中都缺少这两个片段。进一步研究表明 ,这两个片段与簇毛麦的居群无关。因此 ,Xgwm4 98 110和Xgwm4 98 190为簇毛麦 1V染色体所特有 ,可以用来快速跟踪导入普通小麦背景中的簇毛麦的1V染色体。

利用组织培养和辐射诱变创造高频率小麦与簇毛麦染色体易位

利用荧光原位杂交证明普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种培养细胞和再生植株中能够发生属间染色体易位，易位染色体不仅有臂间易位，还有小片段易位，表明通过杂种组织培养是创造属间易位的一个可行的方法。辐射处理能够大幅度促进杂种愈伤组织细胞中的染色体数目和结构变异，特别是易位频率达到7.4％。观察还表明，培养时间对杂种愈伤组织细胞中染色体数目和结构变异都有较大影响，培养细胞的染色体变异在培养的初期阶段就已出现。在一定时间里，随培养时间的延长，未发生变异的细胞频率逐渐下降，染色体数目减少的细胞逐渐增多。培养时间对染色体数目增加的细胞频率影响不大。对于染色体结构变异，培养时间延长主要是提高了端着丝点染色体的频率。在杂种培养细胞中还观察到一定频率的染色体加倍细胞（2n=84），但是培养一段时间后这类细胞就逐渐消失了。

普通小麦与簇毛麦双二倍体的合成、育性及细胞遗传学研究

通过杂种幼胚无性系培养获得大量再生植株F_1,经秋水仙碱处理,合成了普通小麦与簇毛麦属间双二倍体(AABBDDVV)。其形态特征除株高、穗长、小穗数,籽粒大小和育性明显增加,生育期延长外,分别与各自的再生植株F_1相似。双二倍体的体细胞染色体数目变化范围为48—56。花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ 2n=28Ⅱ的细胞占56.82％,每个细胞平均有27.10个二价体,1.44个单价体,0.08个三价体,0.03个四价体。经过连续两代单穗单株选择,结实率由15.91％提高到36.52％。

簇毛麦染色体组特异性RAPD标记的筛选、定位和应用

以普通小麦中国春、中国春 簇毛麦二体附加系以及不同来源的簇毛麦为材料 ,用 10 0个 10碱基随机引物进行RAPD扩增。引物OPF0 2能在不同来源的簇毛麦及所有中国春 簇毛麦二体附加系中扩增出一条长约 75 0bp的片段OPF0 2 750 。普通小麦和硬粒小麦不能扩增出该片段。因此 ,OPF0 2 750 为分布于簇毛麦所有染色体上的一个簇毛麦染色体组特异片段。用引物OPF0 2对普通小麦 簇毛麦双二倍体、硬粒小麦 簇毛麦双二倍体以及几个普通小麦的簇毛麦二体代换系、二体附加系进行检测 ,发现NAU30 2已经丢失了其所附加的簇毛麦

小麦—偃麦草—簇毛麦—黑麦四属杂种的产生及其形态学、细胞学研究

通过胚培养产生了小麦－偃麦草－簇毛麦－黑麦四属杂种。用４个六倍体小偃麦，２个六倍体小簇麦，２个六倍体小黑麦及１个八倍体小偃麦配置了６个四属杂种组合。结果没有出现高度不亲和性。６个组合的杂交结实率分别为６．２％、９．４％、２．４％、９．５％、２５．０％和３．９％；胚培成苗率分别为１２．１％、２０％、３７．４％、４０％、１．１％和７．１％。结果表明，杂交结实率与胚培成苗率间没有相关性。杂种Ｆ１生活力旺盛，形态具有四个属的特征特性。杂种属于自交高不育与低育类型。５个低育类型自交结实率平均约１．２％。四属杂种体细胞染色体数目的变化为３６、３７、３８、３９、４０和４１。其中多数属于具有３８个左右染色体的植株。

簇毛麦对不同白粉病菌菌系的抗性反应及其在小麦遗传背景下的表达

对引自原苏联的簇毛麦（ＨａｙｎａｌｄｉａｖｉｌｏｓａＬ．Ｓｃｈｕｒ２ｎ＝１４ＶＶ）及其与硬粒小麦杂交育成的双二倍体ＴＨ１ＴＨ１ＷＴＨ２ＷＴＨ３ＴＨ３Ｗ，普通小麦－簇毛麦６Ｄ／６Ｖ异代换系及普通小麦亲本和已知抗白粉病基因的１８个小麦品种为供试材料，用８４个来自美国、德国、中国的小麦白粉病菌菌系进行苗期接种鉴定。发现簇毛麦及其衍生系对所有参试的白粉病菌系表现免疫和抗，比供试的已知抗性基因的１８个小麦品种抗性强，抗谱广。其抗性基因在８１０８６Ａ、Ｄ３１１、墨７５、陕７８５９、宛７１０７、冀麦３０等小麦遗传背景下均能很好表达。