米曲霉3.042种曲蛋白酶特性研究

蛋白酶活性中心对米曲霉育种、制曲等研究至关重要,本研究选择四种专一性蛋白酶抑制剂AEBSF、E-64、Pepstatin A和EDTA,研究其对制曲时间为72 h的种曲蛋白酶酶活的影响,并确定三类蛋白酶的活性中心。研究发现酸性蛋白酶的活性中心主要由丝氨酸和天冬氨酸构成,中性蛋白酶的活性中心主要是天冬氨酸,碱性蛋白酶的活性中心最为复杂,含有四大类酶的活性中心。

银杏叶对米曲霉3.042菌生长和蛋白酶活力的影响

该文研究了米曲霉3.042菌在固体培养过程中添加银杏叶对该菌的生长(孢子的形成) 和蛋白酶活力的影响。研究结果表明,银杏叶对于米曲霉3.042菌生长过程中孢子的形成存在明显的抑制作用,而且随着银杏叶添加量的增加,其抑制作用越来越强烈,但对于蛋白酶的生成影响很小。

米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建

米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,最终两种方法分别获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株米曲霉O11和米曲霉g-1。随后以缺陷型突变株为出发菌株,利用农杆菌转化法转入包含pyrG回补标记的质粒,其中米曲霉g-1突变株获得原养型的回补菌株,紫外诱变法获得的缺陷型突变菌株米曲霉O11未能恢复为原养型。研究表明米曲霉3.042 pyrG基因大片段缺失的缺陷型菌株,可直接以自身pyrG基因作为选择标记进行遗传改造。

米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物,但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核,并且对多种抗性药物具有抗性,导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记,其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景,利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株,经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变,确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景,利用农杆菌介导的米曲霉转化系统,成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。

沪酿3.042米曲霉紫外诱变及高活力蛋白酶菌株选育

采用沪酿3.042米曲霉的孢子为对象,对其孢子进行紫外诱变,利用酪蛋白平板对2261株再生株进行初筛,得到34株蛋白酶活力提高的菌株,复筛得到一株蛋白酶活力高且遗传稳定的突变株LY06,37℃培养44h产酶活力由 313U/g曲料高到 556U/g曲料,为原菌株的 1 78 倍,传代培养15次,蛋白酶活力基本保持稳定,没有明显的下降。

米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的研究

研究了酶液组成、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、培养基成分、再生培养方式等因素对米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的影响,建立了米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的适宜方法,即在查氏液体培养基中28℃培养10h,菌体用0.8mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、1%纤维素酶、1%蜗牛酶、0.5%溶菌酶的复合酶液,30℃酶解4h￣6h后,经0.8mol/L NaCl再生固体培养基,双层平板培养法进行原生质体再生,可获得超过70%的再生率。为进一步通过原生质体技术选育优良的酱制品生产用菌株奠定了方法学基础。

活性电泳分析米曲霉沪酿3.042蛋白酶组分

建立了活性电泳分析蛋白酶组分的方法。在制备分离胶时,加入终浓度为0.5%的SDS和1%的酪蛋白,4℃下电泳,以2.5%Triton-X100洗去SDS,在不同条件下温浴,可得到清晰的蛋白酶谱。采用该方法在沪酿3.042的成曲浸提液中检测到7种蛋白酶组分,这些组分在pH中性条件下都有活性,其中3种蛋白酶在pH酸性条件下仍然有很强的活性。这些发现与对米曲霉蛋白酶的传统认识有很大的不同。

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件。以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株。其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定。

复方发酵促进剂对米曲霉沪酿3.042生物活性的影响

就复方发酵促进剂对米曲霉沪酿 3 0 4 2生物活性的影响进行了研究 ,结果表明该促进剂可明显提高米曲霉产蛋白酶的能力 ,最佳添加浓度为 4～ 6× 1 0 - 5 g g培养基时 ,可促进米曲霉生长、繁殖 ,使沪酿 3 0 4 2的蛋白酶产量增加 2 0 %左右 ;该促进剂还具有保护主酶活性等多重功效。

沪酿3.042米曲霉富硒条件的探索

目的:探索沪酿3.042米曲霉的富硒能力并找到最佳的富硒条件。方法:于豆芽汁液体培养基中添加一系列浓度的亚硒酸钠,培养一段时间,研究亚硒酸钠浓度对米曲霉生物量、富硒能力,蛋白酶活力的影响,找到适合的亚硒酸钠浓度,测定此浓度下米曲霉的生长曲线、富硒量曲线,找到最佳的富硒条件,分析此条件下富硒米曲霉胞内硒的存在状态。结果:亚硒酸钠浓度为100mg/L时米曲霉的生物量最大,富硒能力最高,50mL液体培养基可以收获0.454g湿菌体,含有胞内硒2mg,其中有机硒含量达到95%以上,最适合的菌体收获时间是48h。但是此时蛋白酶活力降低明显,亚硒酸钠浓度为50mg/L时蛋白酶活力比不加亚硒酸钠时活力更高,36h达到活力峰,此时富硒能力也较强。结论:米曲霉是个很好的富硒载体,亚硒酸钠浓度为100mg/L时富硒能力最高,应用前景很好。

纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化

以黄豆为原料,通过纯种米曲霉AS3.042制曲,以氨基酸态氮含量为考察指标,采用响应面分析法优化黄豆酱的后发酵工艺条件。结果表明:黄豆酱后发酵期为40d的最适保持温度为40.28℃,添加盐水的最佳浓度为9.66%(质量百分数),该浓度盐水的最适添加量为74.70%(体积百分数)。采用该工艺条件发酵的黄豆酱,其氨基酸态氮含量为0.837 6g/kg,与理论值(0.841g/kg)接近。该工艺可运用于实际生产。

海鞘残渣对米曲霉沪酿3.042生长和酶活力的影响

研究了提取脂肪酸后的柄海鞘残渣对米曲霉沪酿3.042生长和蛋白酶活力的影响。结果表明:柄海鞘残渣代替一部分麸皮作为米曲霉沪酿3.042固体培养基中的主要成分,增加了菌体的生长量和蛋白酶活力,但当海鞘残渣浓度过高时,对米曲霉沪酿3.042的生长和胞外蛋白酶的分泌都有不利的影响。

沪酿3.042米曲霉的纯化复壮

本文报告了酱油生产的主要菌种沪酿３．０４２米曲霉的纯化复壮的方法，并对复壮的新菌株、退化菌株、原始菌株的酶活力、孢子数、生长速度等进行了比绞，结果表明经纯化复壮筛选出的菌株其上述三项指标接近甚至超过原始菌株。

米曲霉孢子原生质体复合诱变及高活力蛋白酶菌株选育

以沪酿3.042米曲霉的孢子原生质体为诱变对象,经溶菌酶2%+蜗牛酶2%+纤维素酶2%,33℃水浴酶解时间5h的孢子原生质体最佳制备条件作用后,对其进行紫外线-氯化锂,NTG复合诱变,并利用酪蛋白平板初筛和固体发酵测定中性蛋白酶活力复筛,筛选了8株高产中性蛋白酶突变株群,为后续的细胞融合、基因组改组等实验提供了优良的候选文库。其中最高产菌株UN97,经37℃培养40h产酶活力为6834U/g(干基),为原菌株的1.62倍,传代培养8次,遗传性能稳定。

响应面法优化富硒米曲霉的培养条件的研究

文章首先用单因素法分别对富硒米曲霉发酵的培养条件:转速、接种量、装液量进行了考察。确定了最佳培养条件为:转速180 r/min,接种量10%,装液量320 mL/L。在此基础上,采用中心组合试验设计结合响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)对影响富硒米曲霉的发酵条件进行进一步优化。结果表明,主要影响因素的最佳条件为:转速180 r/min,接种量10.5%,装液量364 mL/L,米曲霉的胞内硒产量为2.512 mg/g,与理论值2.529 mg/g,相差0.67%。因此,利用响应面分析法对米曲霉富硒的培养条件进行优化合理可行。

米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究

本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化,分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。结果表明:蔗糖27 g·L^(-1),硝酸钠2.5 g·L^(-1),硫酸镁(MgSO_4·7H_2O)0.6 g·L^(-1),初始pH 6.5,在30℃的环境下培养72 h后,米曲霉生长得最好。

统计学分析方法应用于富硒米曲霉发酵培养基的优化

应用Plackett-Burman设计法对影响富硒米曲霉发酵的培养基组分进行了筛选,所选的6个相关因素为:蔗糖、酵母膏、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾和VB1。确定影响富硒米曲霉发酵的关键因素为:氯化钙、酵母膏和VB1。应用最陡爬坡实验逼近以上3个因素的最大响应区域。在此基础上,采用中心组合设计结合响应面法(Response Surface Methodology,RSM)对影响富硒米曲霉富硒发酵的关键因子的范围进行进一步确定,主要影响因素的最佳浓度为氯化钙0.25 g/L,酵母膏28.4 g/L,VB10.015 g/L。验证实验结果表明,采用优化后的培养基,米曲霉的胞内硒含量达到2.268 mg/g,与理论值相差1.4%。因此,利用响应面法对米曲霉富硒的培养基进行优化合理可行。

米曲霉A100-8中与低盐固态酱油发酵相关的酶学性质研究

采用离子注入法诱变米曲霉,经选育得到的纤维素酶、糖化酶、蛋白酶活力较原菌种均有提高的A100-8,通过以米曲霉沪酿3.042大曲为对照,研究A100-8菌株与低盐固态酱油发酵相关的3种酶的酶学性质,发现其更加适合低盐固态发酵工艺低控温的方式。

三种酱油发酵曲霉酶活力的比较

制曲对酱油酿造至关重要,影响着酱油的品质。因此,本研究对酱油制曲过程中的米曲霉A、米曲霉沪酿3.042、米曲霉A100-8 3种曲霉在不同时间的酶活力进行了研究,包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。结合酶活力的变化趋势、原料水解度以及酿造后期淋油的综合情况,最终确定在制曲42h对3株曲霉所制备的大曲进行收曲,比较发现米曲霉A100-8在收曲时,各种酶活表现最佳。

麻仁粕液体发酵的研究

利用米曲霉3.042对火麻仁粕进行液体发酵研究。探索液体发酵法分解麻仁蛋白质的影响因素,包括培养基成分、初始发酵pH、发酵温度、转速、底物浓度等。结果表明,发酵培养基碳源为红糖粉添加量1%,发酵初始pH 7.5,发酵温度30℃,转速180 r/min以及底物浓度7%,发酵48 h时多肽含量达到38.96 mg/g,当发酵时间持续到72 h可得到较多游离氨基酸,含量为0.344%发酵48 h发酵液的香味较好。