酱油酿造米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲胞外蛋白谱鉴定与分析

分析米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲培养过程中不同培养时间的胞外蛋白谱,确定培养时间为48h时种曲达到蛋白鉴定要求;采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)技术检测鉴定出SDS-PAGE胶图上11个蛋白条带,通过比对数据库鉴定得到8个蛋白,其中包括α-淀粉酶、淀粉糖化酶B、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等,与已在2009年Biosci Biotechnol Biochem期刊发表的《Analysis of extra cell ular proteins of Asper gillus oryzae grown on soy sauce koji》米曲霉AS3.951大曲的分泌蛋白谱共同提供了米曲霉沪酿AS3.951在酱油制曲过程中较完整的胞外分泌蛋白谱。

纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化

以黄豆为原料,通过纯种米曲霉AS3.042制曲,以氨基酸态氮含量为考察指标,采用响应面分析法优化黄豆酱的后发酵工艺条件。结果表明:黄豆酱后发酵期为40d的最适保持温度为40.28℃,添加盐水的最佳浓度为9.66%(质量百分数),该浓度盐水的最适添加量为74.70%(体积百分数)。采用该工艺条件发酵的黄豆酱,其氨基酸态氮含量为0.837 6g/kg,与理论值(0.841g/kg)接近。该工艺可运用于实际生产。

米曲霉A-F04的β-果糖基转移酶基因的克隆鉴定及其生物信息学分析

以实验室前期筛选出的高产β-果糖基转移酶（β-fructosyltransferase,β-FTase）的米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A-F04出发,提取米曲霉A-F04基因组DNA和RNA,采用PCR和RT-PCR技术克隆β-FTase基因,得到β-FTase基因完整编码序列和内含子序列,利用重组技术构建β-果糖基转移酶质粒基因库,并构建基因的进化树,预测β-FTase分子量、等电点、氨基酸组成等物化性质,预测其N-糖基化位点和信号肽,运用SWISS-MODEL对β-FTase的三级结构预测。结果显示,成功鉴定出菌株A-F04具有β-FTase基因;菌株A-F04的β-FTase基因编码区长度为1630 bp,含有一个52 bp的内含子,位于173 bp与224 bp之间;编码序列的开放阅读框总长为1578 bp;软件分析得知β-FTase为亲水性的稳定蛋白,其分子量为57.4653 ku,理论等电点为4.83,由525个氨基酸组成;可能的N-糖基化位点有6处;信号肽分析软件得知其编码的1~17位置处的氨基酸为信号肽;SWISS-MODEL构建的3个模型质量较高,有利于后期对β-FTase的结构和功能的研究。

米曲霉A100-8中与低盐固态酱油发酵相关的酶学性质研究

采用离子注入法诱变米曲霉,经选育得到的纤维素酶、糖化酶、蛋白酶活力较原菌种均有提高的A100-8,通过以米曲霉沪酿3.042大曲为对照,研究A100-8菌株与低盐固态酱油发酵相关的3种酶的酶学性质,发现其更加适合低盐固态发酵工艺低控温的方式。

米曲霉Aspergillus oryzae As-W.6对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的降解效果

研究米曲霉Aspergillus oryzae As-W.6对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)的降解作用。经高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测,不同初始质量浓度的DON经菌株As-W.6发酵7 d后,降解率均在35%以上;发酵14 d后,降解率均在90%以上;同时该菌株中提取的降解酶对不同初始质量浓度DON的降解率均达70%以上。对降解产物采用高效液相色谱-质谱(HPLC-mass spectrometry,HPLC-MS)分析检测,结果显示DON经该降解菌降解后,相对分子质量从原来的295.1变为281.2,减少了13.9,说明DON确实被该菌降解成为另一种物质。

米曲霉A100-8酿造黄豆酱的风味研究

目前,国内酿造黄豆酱大都利用米曲霉沪酿3.042。本实验室通过离子注入法诱变米曲霉,得到一株蛋白酶、糖化酶以及纤维素酶活力均有提高的菌株,命名为米曲霉A100-8。本研究分别利用这两种菌株来酿造黄豆酱,通过发酵后酱醪中有机酸和各种风味物质的指标分析来确定米曲霉A100-8是否适合黄豆酱的生产,从而酿造出更优质的黄豆酱。

米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

米曲霉As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为86.7倍,回收率为23.2%,相对分子质量为40.8 ku,酶学性质研究结果表明,该脂肪酶最适反应温度和最适p H分别为40℃和7,在40℃以下和p H6~8之间有较好的稳定性;Ca2＋、Mg2＋和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性,而Cu2＋、Fe2＋、Mn2＋和SDS对其有显著抑制作用;当大豆油作为底物时该脂肪酶的酶活力最高,表明其对大豆油具有显著的特异性。

NTG和UV复合诱变米曲霉A·O-2原生质体选育米蛋白分解菌的研究

以米曲霉A·0—2原生质体为对象,采用NTG和UV作为诱变剂进行单因子和多因子复合诱变处理,在以米渣为主要原料的固体培养基上培养,选育出中性蛋白酶活力较高,生长快,易于培养的变异株N—4.原料配比为:米渣:麦麸:=2:1;培养时间为48小时;培养温度为30℃的培养条件下,变异株N—4的中性蛋白酶活力最高、与出发菌株A·O—2相比,中性蛋白酶活力提高32.6%。

米曲霉A-1植酸酶快速纯化及酶学性质

为进一步了解米曲霉A-1植酸酶,利用超滤及Mono Q阴离子纯化柱纯化,分离出米曲霉A-1的植酸酶Phy A1,分子量约为45kDa,Phy A1在pH 5.5时酶活最高,pH 4.0～9.0较稳定,最适温度为45℃,在60℃以下内切酶稳定性较好。Mg2+、Mn2+对Phy A1植酸酶活性有较好的激活作用。以植酸钠为底物,应用Lineweaver-Burk双倒数作图法得到米氏常数Km为42μmol/L。

米曲霉AS 3.951发酵豆粕对大菱鲆摄食生长的影响

以初始平均体重(2.07±0.02)g的大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)为实验对象,进行为期70天的摄食生长实验,研究不同添加水平的发酵和未发酵豆粕对大菱鲆摄食生长的影响。用米曲霉(Aspergillus oryzae)AS3.951对豆粕进行固态发酵。经检测,与未发酵豆粕相比较,发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆皂甙、水苏糖和棉籽糖的含量分别下降了46.5%、26.6%、11.7%、30.1%和19.7%。实验共制作6种等氮等能的饲料,其中以全鱼粉饲料为对照饲料;未发酵豆粕蛋白分别替代25%、40%和55%的鱼粉蛋白;发酵豆粕蛋白分别替代40%和55%的鱼粉蛋白。结果表明,饲料中添加一定量的豆粕对大菱鲆的成活率没有显著的影响(P>0.05)。饲料中未发酵豆粕蛋白替代鱼粉蛋白的水平为25%时,对大菱鲆的摄食率、特定生长率、饲料效率和蛋白质效率均没有显著的影响,但替代水平为40%和55%时,以上指标显著降低(P<0.01)。饲料中发酵豆粕替代水平为40%时,未降低大菱鲆的摄食率、特定生长率、饲料效率和蛋白质效率,替代水平为55%时,显著降低大菱鲆的摄食率和特定生长率(P<0.01)。

米蛋白分解菌A·0—6的菌种鉴定及其与米曲霉AS．3．951菌株的比较

为了进一步认识经多年选育得到的Ａ·０—６米蛋白分解菌，对其进行了形态及培养特性和生理特性的研究试验，认为Ａ·０—６菌株为半知菌类，丛梗孢目，丛梗孢科，曲霉属，黄曲霉群的米曲霉。与在酿造工业生产上应用多年的米曲霉Ａｓ．３．９５１相比，Ａ·０—６菌株具有蛋白酶活力高，米蛋白分解能力强，生长快，易培养等特点，是值得推广应用的优良菌株。

米曲霉Aspergillus Oryzae细胞分裂规律的研究

本文对米曲霉ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＯｒｙｚａｅ－９１０２菌株的生长过程进行了连续的细胞学观察，结果表明：米曲霉菌株分裂方式主要为有丝分裂，其分裂呈现一定的规律性：每天中有４个分裂高峰期，凌晨３：３０～４：００为分裂最高峰期，初步确定，每次分裂高峰期时间持续０．５小时。

米蛋白分解菌A.0-6的菌种鉴定及其与米曲霉AS3.951菌株的比较

为了进一步认识经多年选育得到的A．0－6来蛋白分解首，对其进行了形态及培养特征和生理特性的研究试验，认为A．0－6菌株为半知菌类，丛便抱目，丛便抱科，曲霉属，黄曲霉群的米曲霉。与在酿造工业生产上应用多年的米曲霉AS3．951相比，A．0－6菌株具有蛋白酶活力高，米蛋白分解能力强，生长快，易培养等特点，是值得推广应用的优良菌株。

米曲霉A-1固体发酵产胞外高活性植酸酶工艺研究

利用桑杆、蔗渣、棉籽壳、板栗壳等农业废弃物为固体碳源,米曲霉A-1为出发菌株,进行固体发酵产植酸酶条件优化研究。试验结果表明,蔗渣为最优固体碳源,NH4NO3为氮源,添加0.5%表面活性剂吐温80以诱导产胞外植酸酶,CaCl2.2H2O更利于酶的提取,40℃培养4 d,酶活达到336 U/g。

米曲霉Aspergilus oryzae发酵生产曲酸的研究

分离到Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｏｒｙｚａｅ１３个菌株，其曲酸产量变化幅度１６６—４８６ｍｇ／ｍｌ，从中选出４个高产菌株。在１％酵母提取物和１５％蔗糖培养液中３０℃发酵培养，８—１０天菌体生长量和曲酸产量达到最大值，随后曲酸产量迅速下降。蔗糖浓度对菌体生长和曲酸产量影响甚大，最适蔗糖浓度为１５％。天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、吡哆醇、叶酸和抗坏血酸有利于菌体生长并显著提高曲酸产量。将在ＹＥＳ培养液中培养１０天的菌体重新悬浮于含１５％蔗糖的ＹＥＳ培养液或０２Ｍ磷酸缓冲液（ｐＨ６５）中８—１０天曲酸产量仍可达到４５ｍｇ／ｍｌ以上。低温条件下制备的培养８—１０天的Ａｏｒｙｚａｅ菌体匀浆反应系统仅有痕量曲酸形成。

米曲霉Aspergillus oryzae M-4降解己烯雌酚的特性研究

以1株分离自酱油曲的米曲霉（Aspergillus oryzae）M-4为材料,初步研究其降解己烯雌酚（diethylstilbestrol,DES）的特性。米曲霉M-4对DES的降解率与菌体生物量呈正相关,在基础盐培养基（mineral salt medium,MM）中培养9 d对100 mg/L的DES降解率为93%。动力学研究表明,该菌株降解DES的过程符合一级动力学方程,在所测试的培养温度、初始pH值、底物质量浓度范围内,DES半衰期为1.645-5.295 d。培养温度30℃和偏酸性环境有利于其对DES的降解;底物质量浓度越高,其半衰期越长。

米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究

通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用。结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn^(2+)和Ca^(2+)对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活。以Asp-pNA为底物时,K_m为0.42 mmol/L,V_(max)为21.57μmol/(mL·min),该酶具有水解N末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性。重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力。

米曲霉A－9005产生酸性蛋白酶的适宜条件

本文研究了米曲霉Ａ－９００５产生酸性蛋白酶的适宜培养基和培养条件。培养基组成（％）为：玉米粉４，黄豆粉５，ＫＨ２ＰＯ４，０．１，ＫＮＯ３０．２，ＺｎＳＯ４０．００１，ｐＨ５，适宜培养温度为３１℃。在上述条件下于往返式摇床（１１０ｒ／ｍｉｎ）培养７２ｈｒ，发酵液的酶活力为８８８２．５μ／ｍｌ。

米曲霉AS3.800基因工程转化体系的构建

采用紫外突变结合砂芯漏斗过滤筛选,得到米曲霉双重营养缺陷型突变菌株AS3.800(niaD-,pyrG-)。应用生物信息学软件辅助分析米曲霉基因,了解转录调控元件。通过PCR技术成功地从米曲霉AS3.800总DNA中分别扩增niaD、pyrG基因表达框(expression cassette),构建筛选标记质粒pUCniaD和pUCpyrG,并尝试原生质体转化AS3.800(niaD-,pyrG-)。

过表达米曲霉AoNarmp1基因对米曲霉生长和曲酸合成的影响

Nramp(natural resistance associated macrophage protein)家族蛋白是一类广泛存在于生物界的膜转运蛋白,在金属离子的转运和利用中起着非常重要的作用。尽管米曲霉Nramp家族基因AoNramp1已被克隆,但它对米曲霉生长和曲酸合成的影响还不明确。本研究利用米曲霉α淀粉酶基因amyB启动子构建了AoNramp1过表达菌株。表型分析表明,过表达AoNramp1抑制了米曲霉菌丝生长、孢子形成,增加了菌球和孢子的直径。曲酸含量和基因表达分析表明,转运蛋白AoNramp1可能是通过抑制曲酸合成相关基因kojA、kojR、kojT的表达来抑制米曲霉曲酸的合成。