Lee氏法测米氏常数的实验观察

目的：介绍、说明和应用Ｌｅｅ氏法测米氏常数（Ｋｍ）。方法：用尿素酶与尿素反应１０秒钟，用二乙酰一肟终止反应，并测定和换算出反应体系底物浓度［Ｓｔ］与初始底物浓度［Ｓｏ］，代入Ｌｅｅ氏方程式。结果：尿素酶Ｋｍ为２．９×１０－３ｍｏｌ／Ｌ～３．１×１０－３ｍｏｌ／Ｌ，最大反应速度Ｖ为２．２×１０－４ｍｏｌ／Ｓ（原液）与１．２×１０－４ｍｏｌ／Ｓ（１／２稀释液）。结论：Ｌｅｅ氏法测Ｋｍ准确、简便，受底物消耗的影响小，反应进行了５０％时，相对百分误差还不到４％。

引江济太对太湖水体碱性磷酸酶动力学参数的影响

采用野外定点采样、室内同步分析水体碱性磷酸酶活性及水化学指标的方法,研究引江济太调水对太湖各湖区水体碱性磷酸酶最大反应速率(vmax)、米氏常数(Km)值的影响。结果表明:在引江济太调水试验期间,各湖区水体中vmax及Km值时空分布存在差异性。调水稀释了各湖区蓝藻浓度,抑制了水体碱性磷酸酶vmax;贡湖区、西岸河口区及湖心区水体中Km值与入湖累积水量之间有显著的二次函数关系(p=0.007)。梅梁湖、竺山湖、贡湖及西岸河口区水体碱性磷酸酶vmax/Km随着总磷浓度升高而增加,但竺山湖、贡湖、草型湖、湖心及西岸河口区水体vmax/K随生物可利用磷(PO3--P)浓度增加而下降。除草型湖区外,其它湖区水体v/K随叶绿素a浓度升高而增加。

兔子和小鼠不同组织苹果酸脱氢酶活性的研究

本文采用苹果酸脱氢酶(MDH)催化过程中辅酶Ⅰ氧化还原型转化的特征,测定了兔子和小鼠不同组织MDH的比活力和米氏常数(km),比活力在370～1 055单位/mg蛋白之间,km范围为3.57～6.49×10-5mol/L.快速老化小鼠病理模型的km增大10倍,为1.49～5.64×10-4mol/L.

自选酿酒酵母(KDLYS9-3)产β-D-葡萄糖苷酶动力学研究

自选高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母(KDLYS9-3)在葡萄酒酿造过程中具有增强香气的效果。依据菌体生长和产酶试验,利用Logistic方程、Dose Resp方程和Nelder方程建立了菌体生长和产酶,以及菌体生长速率与酶生成速率之间关系的动力学模型,通过Origin8.0软件进行非线性拟合,并利用Lineweaver-Burk法作图测定了该菌所产β-D-葡萄糖苷酶的动力学参数K_m值和V_(max)值。结果显示:自选酿酒酵母KDLYS9-3的菌体生长与产酶的相关性为部分偶联型,动力学模型与试验值吻合度好,方程能够反映菌体生长与产酶的变化规律。菌体生长8 h后开始产酶,菌体进入对数生长期时酶大量生成,到39 h菌体生长进入稳定期,随着菌体生长进入衰亡期后酶也随之停止产生;利用Lineweaver-Burk法求得酶动力学参数K_m=8.492 579 mmol/L,V_(max)=1.030 715(μmol/L)/min。研究结果为该菌株的理论研究和实际应用奠定了基础。

纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究

目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离纯化,采用TAME法测定酶的活性,通过SDS-PAGE对纯化结果进行了检验。结果SDS-PAGE中显示单一色带,相对分子质量28000,以TAME为底物时纳豆激酶的米氏常数(Km)为35.47mmol/L,最适宜的温度37℃,最适宜pH为8.6。结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。

Fast estimation of Michaelis-Menten constant of arylesterase with a pair of medium concentrations of substrate

Objective: To investigate the reliability for fast estimation of Michaelis-Menten constant (Km) with calibrated specific activity at only two medium concentrations of substrate by both simulation and experimentation with arylesterase (ArE)as model. Methods: Initial rates were simulated by randomly inserting uniform absolute error, and the experimental initial rates of ArE were determined by measuring the increaser of product absorbance. Calibrated specific activities at two substrate concentrations were obtained by regression analysis, and Km was calculated according to Michaelis-Menten equation. Results: By simulation with calibrated specific activities at two medium substrate concentrations, Km could be calculated according to Michaelis-Menten equation with reasonable precision and accuracy. By experimentation with substrates of 2-naphthyl acetate, phenyl acetate, and p-nitrophenyl acetate, there were no differences between the mean and SD of Km of ArE for either substrate by this linear kinetic method and the Lineweaver-Burk plot. Conclusion: This linear kinetic method was reliable for fast estimation of the Km of some specified enzyme on its substrate of lower solubility or lower sensitivity for quantification by common methods.

太湖水体中碱性磷酸酶的空间分布及生态意义

在对太湖生态湖区进行分区的基础上,监测各湖区水体碱性磷酸酶活性、动力学参数以及常规水环境化学指标,探讨水体碱性磷酸酶活性的空间分布特征及其环境影响因素.结果表明,太湖水体碱性磷酸酶活性(APA)、最大反应速率(Vmax)值及碱性磷酸酶反应米氏常数(Km)值分布均呈空间异质性;APA与Vmax值具有相似性的空间分布规律,即西岸河口区水体中APA值与Vmax值最大,分别为(9.43±5.30)nmol.(L.min)-1和(13.70±7.42)nmol.(L.min)-1,在其他湖区依次为湖心区>草型湖区>梅梁湾区>竺山湖区>贡湖区;草型湖区Km值(20.50±11.30)μmol.L-1>贡湖区>竺山湖区>梅梁湾区>湖心区>西岸河口区(9.17±3.46)μmol.L-1.太湖水体中Vmax与pH、总磷(TP)、叶绿素a(Chla)之间均存在显著的线性正相关,其相关系数分别为rpH=0.651 2**(p<0.01)、rTP=0.488 5**(p<0.01)、rChla=0.765 6**(p<0.01),但与水温、溶解性总磷(DTP)、正磷酸盐(PO43--P)无显著的相关性;Km值与TP浓度间呈显著的线性负相关性,相关系数为rTP=-0.383 4*(p=0.048),与水温、pH、DTP、PO43--P以及Chla浓度的相关性不显著.

葎草酮抑制人胃癌细胞SGC-7901 N-乙酰基转移酶1活性的酶动力学研究

目的探讨葎草酮对人胃癌SGC-7901细胞N-乙酰基转移酶1(NAT1)酶动力学常数的影响。方法采用HPLC法,以NAT1酶特异性底物对氨基苯甲酸(PABA)为底物,以SGC-7901完整细胞及细胞质内PABA被NAT1乙酰化为Ac-PABA的速度为NAT1酶的反应速率,采用双倒数作图法,以底物PABA浓度的倒数对NAT1反应速率的倒数进行直线回归,得出回归方程,计算米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。结果酶动力学研究表明,以PABA为底物,对于SGC-7901完整细胞,阴性对照组的Km和Vmax分别为(3.910±0.087)μmol/L、(0.306 0±0.006 7)pmol(1×106个细胞),葎草酮组的Km和Vmax分别为(3.830±0.123)μmol/L、(0.275 0±0.005 8)pmol(1×106个细胞),对于SGC-7901细胞质,阴性对照组的Km和Vmax分别为(760.2±210.2)μmol/L、(0.191 0±0.043 7)pmol/(mg.min),葎草酮组的Km和Vmax分别为(449.0±72.9)μmol/L和(0.094 0±0.010 4)pmol/(mg.min),数据经统计学处理表明对SGC-7901完整细胞或细胞质中的NAT1酶,阴性对照组和葎草酮组的Km没有统计学差异,而Vmax有显著差异。结论葎草酮是SGC-7901人胃癌细胞NAT1酶PABA底物的非竞争性抑制剂。