Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法优化赪桐中类叶升麻苷纯化工艺及其稳定性分析

为优化赪桐中类叶升麻苷的纯化工艺,并分析其稳定性,试验对8种不同型号的大孔树脂进行吸附-解吸能力比较,筛选出最优的大孔树脂型号;采用Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法,考察上样液浓度、上样液流速、洗脱液浓度等因素水平,优化赪桐中类叶升麻苷的纯化工艺。通过高效液相测定纯化物在不同温度、光照、pH、抗氧化剂等环境条件下类叶升麻苷的含量。结果表明:赪桐中类叶升麻苷最佳纯化工艺条件为ADS-7型号大孔吸附树脂、上样液浓度9.0 mg/mL、上样液流速3.0 m L/min、洗脱液浓度58%,验证试验中的类叶升麻苷回收率可达到76.04%,与所建模型预测接近;稳定性试验表明,温度越高、光照时间越久、pH越高、类叶升麻苷的稳定性越差。同时,添加抗氧化剂可以明显增强其稳定性。故纯化后的类叶升麻苷应在低温、避光、酸性环境中贮藏和使用,且可通过添加不同种抗氧化剂延长其使用期限。采用Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法优化赪桐中类叶升麻苷纯化工艺稳定可行,可为后续抗奶牛乳房炎中草药型饲料添加剂产品的研发及产品稳定性使用提供理论依据。

类叶升麻苷大鼠安全性评价

目的通过单次给药和重复给药毒性试验,初步评价类叶升麻苷的安全性,为深入全面开展其安全性评价奠定了基础。方法单次给药毒性试验,SD大鼠随机分为溶媒对照组和给药组(5000 mg·kg^(-1)),经口单次给药,观察并记录14 d内大鼠一般临床症状、死亡情况、体重;对主要脏器进行肉眼观察。重复给药毒性试验,SD大鼠随机分为溶媒对照组,类叶升麻苷低(100 mg·kg^(-1))、中(500 mg·kg^(-1))、高(2000 mg·kg^(-1))剂量组,每组30只,连续给药28 d,恢复28 d,观察并检测一般临床症状、体重、摄食量、尿常规等相关指标。结果单次给药毒性试验中各动物无死亡、无异常、与溶媒对照组相比,体重差异无统计学意义(P>0.05),脏器组织无肉眼可见病变。重复给药毒性试验中,与溶媒对照组相比,大鼠体重、摄食量、凝血指标、脏器湿重及系数差异无统计学意义(P>0.05);对血液学、肝功能和肾功能无毒理学影响,高剂量组脏器组织未见明显给药相关组织病理学改变;高剂量组雌性动物尿常规中出现白细胞、酮体阳性检出率偏高(P<0.05或P<0.01),存在可逆性。结论单次给药毒性试验中,类叶升麻苷单次给药最大耐受剂量(MTD)>5000 mg·kg^(-1),重复给药毒性试验中,类叶升麻苷无明显毒性反应剂量(NOAEL)为500 mg·kg^(-1)。

类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用

目的 观察类叶升麻苷对小鼠学习记忆能力的影响。方法 用东莨菪碱致小鼠记忆获得性障碍模型 ,以行为学实验 (跳台法、水迷路法 )、大脑皮层和纹状体乙酰胆碱酯酶活性和M受体的最大结合力为指标观察类叶升麻苷的作用。结果 在东莨菪碱致小鼠记忆障碍模型中 ,类叶升麻苷可延长跳台实验的平台停留期 ,并显著减少错误次数 ;在水迷路实验中可提高正确反应百分率 ;并能拮抗东莨菪碱所引起的大脑皮层乙酰胆碱酯酶的增高及皮层、纹状体M受体最大结合力的降低。结论 类叶升麻苷对东莨菪碱所引起的小鼠学习记忆能力障碍有改善作用 。

类叶升麻苷对肾阳虚小鼠补肾壮阳作用的研究

腹腔注射氢化可的松建立小鼠肾阳虚模型,类叶升麻苷[40、20 mg·(kg·d)^(-1)]连续灌胃14 d。测定阴茎勃起潜伏期、性器官脏器系数、精子数量,光学显微镜观察睾丸形态结构。研究管花肉苁蓉化学成分类叶升麻苷对肾阳虚小鼠的补肾壮阳作用。结果表明:与模型组比较,类叶升麻苷(40 mg·kg^(-1))可极显著缩短阴茎勃起潜伏期(P<0.01),增加精子数量(P<0.01),显著提高性器官脏器系数,改善睾丸形态结构。低剂量类叶升麻苷亦可缩短勃起潜伏期(P<0.01),增加精于数量(P<0.05),提高性器官脏器系数(P<0.05),改善睾丸形态结构。证明类叶升麻苷对肾阳虚小鼠具有补肾壮阳作用。

类叶升麻苷在大鼠体内的药代动力学及组织分布研究

目的研究类叶升麻苷(acteoside)在大鼠体内的药代动力学及组织分布特征。方法大鼠灌胃给予300 mg·kg-1的类叶升麻苷后,采用HPLC检测各时间点血浆和组织器官药物浓度,并用DAS2.0软件计算药代动力学参数。结果大鼠灌胃给药后,药时曲线符合二室开放模型,主要药动参数分布半衰期T12α、消除半衰期T12β、曲线下面积AUC、血浆清除率CL分别为:2.37 h、2.916 h、1.031μg·L-1·h、306.241 L·h-1。结论类叶升麻苷体内吸收符合一级动力学,主要分布在肠、肺脏、脾脏组织中,在所研究的组织中未见特殊蓄积现象。

类叶升麻苷对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用

目的研究类叶升麻苷在MPTP诱导的C57小鼠的帕金森病(PD)模型中的神经保护作用及机制。方法通过自主活动实验和滚筒实验研究动物的行为表现,通过高效液相电化学检测方法观察脑纹状体多巴胺的变化,通过脑黑质酪氨酸羟化酶(tyroxinehydroxylase,TH)免疫组化染色观察多巴胺能神经元的损伤程度。并对黑质纹状体进行α-突触核蛋白(α-synuclein)的免疫印迹分析以探讨药物作用机制。结果①经MPTP诱导的C57小鼠,其自主活动次数、滚筒运动潜伏期均低于对照组(P<0·01);纹状体多巴胺含量明显降低(P<0·01);多巴胺能神经元数量明显减少;黑质纹状体α-synuclein蛋白水平下降。②经类叶升麻苷(10、30mg·kg-1)预处理后能明显改善MPTP诱导的C57小鼠的行为学表现,增加脑内多巴胺递质的含量,增加多巴胺能神经元的数量,增加黑质纹状体α-synuclein蛋白水平。结论类叶升麻苷具有神经保护作用,能对抗MPTP诱导的C57小鼠PD模型中的神经损伤。其机制可能与上调α-synuclein蛋白水平有关。

类叶升麻苷抗鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤机制的研究

目的研究类叶升麻苷抗鱼藤酮致多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞损伤,对帕金森病相关蛋白Parkin、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)表达的影响,探讨类叶升麻苷抗细胞损伤的分子机制。方法化学比色法测定细胞培养液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,蛋白质印迹法(Western blot)检测Parkin、α-Syn的表达,免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞α-Syn分布。结果①类叶升麻苷(10,20或40mg.L-1)可明显降低鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放;②0.5μmol.L-1的鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞48h能引起Parkin蛋白的明显降解及α-Syn蛋白二聚体增加;③预先用类叶升麻苷(10,20或40mg.L-1)处理细胞,能够有效减少鱼藤酮诱导的Parkin蛋白的降解,呈浓度依赖性;并能够抑制鱼藤酮诱导的α-Syn蛋白二聚体增加及α-Syn阳性细胞数增加。结论类叶升麻苷对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤具有神经保护作用,其作用机制可能与减少Parkin蛋白的降解和抑制α-Syn蛋白的二聚体形成有关。

类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用

目的观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法采用卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)建立大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型,测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和一氧化氮(NO)在不同培养时间点(3,6,12和24h)的含量。结果与模型组相比较,类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ALT、AST和NO水平(P<0.01),且呈剂量依赖关系。结论类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有保护作用。

类叶升麻苷对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的探讨类叶升麻苷对鱼藤酮致多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制。方法采用MTT法检测细胞存活率,以荧光染料Hoechst33342染色分析细胞核的形态学变化,用流式细胞仪定量分析细胞凋亡峰,以2,′7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)为标记探针检测细胞内活性氧的产生。结果①0.5μmol.L-1的鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞48 h能引起细胞存活率的显著下降;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达47.39%;大部分细胞胞体皱缩,突起缩短消失或断裂;染色质皱缩、浓缩、断裂及形成凋亡小体;细胞内活性氧水平上升。②预先用盐生肉苁蓉提取物类叶升麻苷(10,20或40 mg.L-1)处理细胞6 h,可提高细胞存活率;明显改善鱼藤酮引起的细胞形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到25.87%,23.97%,10.45%;以DCFH-DA为标记探针检测到20 mg.L-1类叶升麻苷可明显抑制鱼藤酮引起的细胞内活性氧产生。结论类叶升麻苷能抑制鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与降低细胞内活性氧水平有关。

类叶升麻苷对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究

目的研究类叶升麻苷对D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力和氧化作用的影响。方法将昆明种小鼠随机分为空白对照组、模型组、石杉碱甲组和类叶升麻苷高、中、低剂量组。空白对照组颈背部注射生理盐水,其余各组颈背部注射D-半乳糖(150 mg·kg-1·d-1)造模,连续90d。从第71天开始石杉碱甲组和类叶升麻苷低、中、高剂量组分别灌胃给药,连续20 d。采用Morris水迷宫测试小鼠的学习记忆能力,然后检测血清和脑组织内的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。结果与模型组相比,给予类叶升麻苷和石杉碱甲后可以改善小鼠的学习记忆能力,其潜伏期和游泳距离均明显缩短(P<0.05)。与空白对照组相比,模型组小鼠血清和脑组织内SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比,类叶升麻苷组在给药后均能明显提高小鼠血清和脑组织内SOD和GSH-Px活性(P<0.01),降低血清和脑组织内MDA含量(P<0.01)。小鼠学习记忆能力与血清和脑组织内SOD、GSHPx活性以及MDA含量相关(P<0.01)。结论类叶升麻苷能够改善小鼠学习记忆功能,提高血清和脑组织内抗氧化酶活性,降低MDA含量。

类叶升麻苷通过激活ERK1/2诱导血红素加氧酶-1的表达

目的探讨类叶升麻苷(actesoide)诱导血红素加氧酶-1(HO-1)表达的信号机制。方法类叶升麻苷单独处理体外培养的PC12细胞或运用ERK1/2抑制剂PD98059预处理,提取细胞蛋白,Western blot方法检测pERK1/2和ERK1/2以及HO-1蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,类叶升麻苷可以诱导HO-1的表达上调,类叶升麻苷激活ERK1/2,后者激活介导类叶升麻苷诱导HO-1的表达上调,因为PD98059预处理后可以减弱类叶升麻苷引起的HO-1蛋白表达水平降低。结论类叶升麻苷通过激活ERK1/2通路诱导HO-1的表达。

类叶升麻的化学成分研究

目的:研究我国药用植物类叶升麻Actaea asiatica根茎的化学成分,为阐明其有效成分提供依据。方法:利用硅胶柱色谱,反相柱色谱,半制备液相进行分离,根据化合物的光谱数据(IR,MS,1H-NMR,13C-NMR)和化学方法鉴定其结构。结果:从根茎的醋酸乙酯萃取物中分离得到6个化合物,分别鉴定为25-O-乙酰升麻醇(1),12β-羟基升麻醇(2),23-epi-26-deoxyactein(3),27-deoxyacetylacteol(4),26-deoxycimicifugenin(5)及β-谷甾醇(6)。结论:以上化合物均为首次从该属植物中分离得到。

类叶升麻苷在体内诱导血红素加氧酶-1的表达

目的探讨类叶升麻苷(AS)是否在体内诱导血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。方法 AS 12.5 mg/kg和25 mg/kg以腹腔注射的方式给予SD大鼠,在特定时间处死大鼠,取大脑皮层和纹状体组织以及肾脏和肝脏组织。提取组织蛋白,Western印迹方法检测HO-1。结果与正常对照组相比,AS可在皮层和纹状体中剂量依赖性诱导HO-1的表达上调,在外周肾脏和肝脏组织中AS剂量依赖诱导HO-1的表达上调。结论 AS可在体内诱导HO-1的表达。

类叶升麻苷通过诱导血红素加氧酶-1的表达抑制MPP^+诱导的PC12细胞损伤

目的探讨类叶升麻苷(AS)是否在PC12细胞中诱导血红素加氧酶-1(HO-1)的表达进而抑制1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的神经毒性损伤。方法类叶升麻苷(1、20和30μmol/L)处理PC12细胞12 h,利用反转录PCR(RT-PCR)检测HO-1 mRNA表达、Western blot方法和免疫荧光方法检测HO-1蛋白的表达。1mmol/L MPP+单独或与AS处理细胞,或HO-1抑制剂锌原卟啉(Zn PP)预处理细胞1 h,MTT法检测细胞活力。结果与正常对照组相比,AS可在PC12细胞中诱导HO-1 mRNA和蛋白的表达,AS诱导的HO-1表达主要集中在胞浆内。HO-1抑制剂Zn PP减弱AS对MPP+诱导损伤的抑制作用。结论 AS可在PC12细胞中诱导HO-1的表达,可能参与AS对MPP+诱导损伤的抑制作用。

类叶升麻苷增强致亚急性衰老小鼠脑组织神经营养因子3的表达

目的观察类叶升麻苷对D-半乳糖联合AlCl3致亚急性衰老模型小鼠脑组织神经营养因子3(NT-3)表达的影响。方法雌性昆明小鼠随机分为溶媒对照组、亚急性衰老模型组、维生素E组、吡拉西坦组和类叶升麻苷治疗组。腹腔注射D-半乳糖60 mg/(kg·d),AlCl35mg/(kg·d)灌胃,连续90 d,建立亚急性衰老小鼠模型。荧光定量PCR检测小鼠脑组织NT-3 mRNA表达水平,免疫组织化学技术和Western blot法检测NT-3的蛋白表达。结果 NT-3在亚急性衰老模型小鼠脑组织中表达明显降低。模型小鼠给予类叶升麻苷、维生素E、吡拉西坦后,脑组织NT-3 mRNA和蛋白表达水平均显著增强。结论类叶升麻苷可以促进亚急性衰老小鼠脑组织中NT-3 mRNA和蛋白表达水平增强。

类叶升麻苷的药理作用及药物代谢动力学研究进展

目的:总结类叶升麻苷药理作用及药动学研究进展,为开发研究提供参考依据。方法:查阅相关的文献报道进行综述。结果:类叶升麻苷药理作用广泛,尤其是抗氧化、抗衰老、增强记忆和神经保护作用等更为突出。其吸收迅速,生物利用度较低,体内分布广泛且存在系统前代谢情况。结论:类叶升麻苷药理活性强、毒副作用小,具有很好的开发前景。

类叶升麻毛茛科次生木质部管状分子的研究

利用扫描电子显微镜对毛茛科类叶升麻(Actaea asiatica Hara)根和根状茎次生木质部中的管状分子进行观察，发现其管状分子类型丰富，主要有：管胞、管胞状导管、纤维导管和典型的导管分子，其中管胞、管胞状导管和纤维导管为在该类群中首次报道；在导管分子中，存在着梯状穿孔板、网状穿孔板、混合型穿孔板和单穿孔板，其中网状穿孔板和混合型穿孔板为在该类群中的首次报道；对其导管分子上的侧壁穿孔板、多穿孔板和纹孔膜残余也进行了描述。根据类叶升麻次生木质部中多变的管状分子类型，认为以往积累的有关毛茛科植物管状分子类型及导管穿孔板类型是不全面的，因此以该性状为参考作出的有关某一个类群的原始性和进化性的推论也是不可靠的。同时探讨了不同类型管状分子在类叶升麻不同器官的分布与其生理功能和生态环境的关系，同时将该植物作为毛茛科的代表类群，与其它基部类群植物导管分子进行了比较。

类叶升麻苷对β-淀粉样蛋白聚集影响的体外研究

目的研究类叶升麻苷(Acteoside,AS)在体外对β-淀粉样蛋白片段(Aβ_(1-42))聚集的影响。方法采用硫黄素T(Th-T)结合实验研究各个浓度AS对单体态Aβ_(1-42)聚集的抑制作用以及对聚集态Aβ_(1-42)的解聚作用、呈现出的量效关系;通过对AS和AS+Th-T进行300~600nm全波长吸收光谱扫描以及(160、320、640μmol/L)AS与(1.25、2.5、5、10、20、40、80、160和320μmol/L)Th-T竞争结合实验,排除实验中可能存在的假阳性因素。结果硫黄素T结合实验表明,加入AS共同孵育24h后,单体态或聚集态Aβ_(1-42)的荧光强度均能减弱;全波长吸收光谱扫描显示在450nm和485nm处,AS、AS+Th-T均无特异性吸收峰,在450nm处给予刺激后,485nm附近也没有出现强的吸收;竞争结合实验表明,固定AS浓度,增加Th-T浓度,不会使荧光强度恢复至未加入AS组,则两者不存在相关结合位点;在AS影响Aβ_(1-42)聚集的量效关系实验中,AS抑制Aβ_(1-42)聚集的IC_(50)为254.3μmol/L,对聚集态Aβ_(1-42)解聚的IC_(50)为282μmol/L。结论 AS可有效抑制单体态Aβ_(1-42)的聚集,对聚集态的Aβ_(1-42)也有明显解聚作用,提示AS对老年痴呆具有潜在的治疗作用。

类叶升麻苷对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用

目的研究类叶升麻苷对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的影响。方法将PC12细胞分为正常对照组、模型对照组、阳性药组和类叶升麻苷给药组。除正常对照组外,其余各组均以1.5 mmol·L-1谷氨酸处理24 h,再分别以10μmol·L-1维生素E和15.625,31.25,62.5,125,250μmol·L-1类叶升麻苷作用。通过倒置显微镜观察细胞形态,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,酶标法试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸(TBA)法试剂盒测定丙二醛(MDA)含量,WST[2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐]法试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测胞内活性氧(ROS)含量。结果与模型对照组比较,除类叶升麻苷Ⅰ组(15.625μmol·L-1AS)以外,其余各类叶升麻苷给药组均可明显改善PC12细胞形态,提高细胞存活率和SOD酶活性(P<0.01),抑制LDH活性及MDA和ROS生成(P<0.01或P<0.01)。结论类叶升麻苷对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。

基于神经网络和响应面法优化赪桐中类叶升麻苷提取工艺及其抑菌活性研究

试验旨在优化赪桐中类叶升麻苷的提取工艺并研究其抑菌活性。通过单因素试验、响应面试验、神经网络法以赪桐中类叶升麻苷的得率为考察指标,优化提取工艺;研究最佳工艺提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、无乳链球菌的抑菌效果。结果显示:最佳提取工艺条件为粒度目数100目、提取温度80℃、液料比13 mL/g、乙醇浓度63%、提取时间90 min、提取3次,此条件下类叶升麻苷得率为12.27 mg/g。最佳工艺提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用,对耻垢分枝杆菌、无乳链球菌则无明显的抑制作用。研究表明,提取工艺优化后赪桐中类叶升麻苷得率相对较高,具有良好的抑菌效果。