17α-甲基睾丸酮和来曲唑对尼罗罗非鱼类固醇激素合成酶基因表达的影响

用质量浓度为10 mg/kg的17α-甲基睾丸酮(MT)、芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)分别对尼罗罗非鱼进行腹腔注射,在注射后12、24、48 h和7、14、21 d检测P450arom、11β-HSD2、P450scc基因表达量。结果表明,3个基因表达量均先下调,而后回升。注射MT后,最先受到抑制的是P450scc基因,其次是P450arom和11β-HSD2基因。11β-HSD2基因的表达量在注射后7、14、21 d时均与对照组存在显著差异(P<0.05),其中14 d时的表达量降至最低;P450scc基因的表达量在注射后12、24、48 h与对照组存在显著差异(P<0.05),其中24 h时表达量降至最低;P450arom基因至48 h时表达量降至最低,与对照组存在显著差异(P<0.05)。注射LE后,P450arom和P450scc基因的表达较11β-HSD2基因先受到抑制。11β-HSD2基因的表达量在注射后48 h,7 d、14 d时均与对照组存在显著差异(P<0.05),其中7 d时降至最低;P450scc基因和P450arom基因的表达量均在注射后48 h时表达量降至最低,且与对照组存在显著差异(P<0.05)。实验结果表明,MT可能是通过调节P450scc基因水平来降低P450arom的表达量,而LE则通过直接调节P450arom基因的表达进而影响罗非鱼类的性别形成。

鸡胚性腺内黄体生成素受体和类固醇激素合成酶基因的性别差异性表达

促性腺激素受体，包括黄体生长素受体（LHR）和卵泡刺激激素受体，通过调节粝固醇激素合成和细胞增殖从而对性腺的发育和功能起重要作用。虽然鸟类的性别由性染色体所决定，但性腺的发育要受到很多诸如类固醇激素这样因素的影响。既然雄性和雌性的性腺有不同的形态特征和功能，促进性腺激素和类固醇激素对它们发育的调节作用不可能是不同的。本实验的目的是研究鸡胚发育过程中性腺内LHRmRNA表达的变化及其与类固醇激素合成酶mRNA的相关性。在孵化的第10天至孵化后第14之间取出鸡胚的性腺，然后用Northern杂交法检测LHR和P450c17及P450arom mRNA的表达。结果显示：在孵化期间LHR mRNA有3．0和1．5kb两种转录产物，孵化后还出现7．0kb的转录物（Fig.1）。在孵化期间1．5kb转录物的含量高于3．0kb的转录物，而孵化之后则相反。卵巢内LHRmRNA（3．0kb）的水平从孵化的第12天开始升高，两天这后达一高峰，此后一直保持在较高水平。与此不同的是睾丸内LHRmRNA的表达量在孵化期间较低，孵化后立即升高（Fig.2)。P45c17mRNA的表达与LHRmRNA相似（Figs,3&4)。P450arom mRNA基卵巢内的表达量较高，孵化后其主带从2．0kb转变为4．0kb。睾丸内P450arom mRNA的表达量极低（Figs.5&6)。在相应的时期，左侧和右侧睾丸内三种基因的表达水平都无显著差别。孵化前后，这三种基因表达所发生的较大变化可能与此时性腺内合成类固醇激素细胞的发育有关。在胚胎卵巢内，LHR、P450c17和P450arom mRNA的表达量较高，提示：雌性胚胎性腺内粝固醇激素合成作用要强于雄性胚胎。

不同程度邪毒证H22荷瘤小鼠肾上腺皮质酮合成酶及其转录因子表达的差异

目的:探讨小鼠荷瘤状态下不同程度邪毒证肾上腺皮质酮合成与分泌的差异。方法:在220只昆明种小鼠右腋下接种H22肝癌腹水细胞,复制肝癌荷瘤小鼠模型,于接种肿瘤后第9天进行小鼠四诊检测,依据邪毒程度将各荷瘤小鼠排序,并排除气血阴阳虚证小鼠,筛选邪毒壅盛证组18只、邪毒微弱证组18只,并以18只正常小鼠为对照组。第11天处死各组小鼠,剥离肿瘤称瘤重,用ELISA方法检测血浆激素含量;应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠肾上腺组织Cyp11b1、Cyp11a1、Star、Fdx1、Fdxr、Mc2r、Nr4a1、Nr5a1、Nr0b1、Gata6基因mRNA表达,并以Gapdh和β-actin两个基因作内参照;应用Western blot方法检测St AR和CYP11A1蛋白表达。结果:邪毒壅盛证小鼠肿瘤质量明显大于邪毒微弱证组(P<0.05);不同程度邪毒证肝癌小鼠血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)均高于正常组(P<0.05);皮质酮合成最后一步关键酶Cyp11b1、促肾上腺皮质激素受体(Mc2r)及铁氧还蛋白还原酶(Fdxr)基因表达在邪毒壅盛证组显著升高(P<0.05);转录抑制因子Nr0b1在邪毒壅盛证组明显低于邪毒微弱证组(P<0.05);转录因子Nr4a1、Nr5a1和Gata6基因表达在不同程度邪毒证肝癌小鼠均高于正常组(P<0.05);St AR蛋白表达在不同程度邪毒证肝癌小鼠均显著升高(P<0.05)、且邪毒壅盛证组显著高于邪毒微弱证组(P<0.05)。结论:小鼠肿瘤形成后,邪毒程度越重者,为适应机体慢性应激反应,其肾上腺皮质功能呈现失代偿性增加,导致垂体与肾上腺皮质激素储备功能减少,可能与邪毒壅盛证荷瘤小鼠带瘤生存期缩短有关,提示肿瘤早期治疗也需注意扶助正气。

黄柏酮通过影响线粒体功能抑制肾上腺皮质瘤细胞皮质酮合成的研究

目的研究黄柏酮对肾上腺皮质激素合成与分泌的影响。方法体外培养Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞,采用2.5~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,运用MTT法检测细胞活性;以80μmol/L黄柏酮处理细胞24 h后采用流式细胞术检测细胞周期,共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜变化;以ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量;以40~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,80μmol/L黄柏酮干预细胞24~48 h,运用qPCR法检测皮质酮合成酶mRNA表达,Western blot检测其蛋白表达。结果与对照组比较,2.5~40μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率约为35%(P<0.05),160μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率为60%以上(P<0.01)。黄柏酮导致G1期细胞显著增加并促进线粒体膜亮度增强(P<0.05),同时显著抑制线粒体膜Mfn1、Mfn2蛋白表达以及皮质酮分泌(P<0.05)。进而发现,40~160μmol/L黄柏酮显著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表达(P<0.01),160μmol/L黄柏酮显著增强Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表达(P<0.01);80μmol/L黄柏酮持续给药48 h内,均显著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表达(P<0.01),并抑制StAR、CYP11A1蛋白表达,然而促进Star基因表达(P<0.01)。结论黄柏酮抑制肾上腺皮质细胞皮质酮合成过程,可能与其阻滞细胞周期及影响线粒体膜上类固醇激素合成酶表达有关。

佛司可林促进小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质酮分泌的作用研究

目的研究佛司可林(FSK)对小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质激素的促分泌作用。方法以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,采用1、10μmol·L-1FSK处理Y1细胞15min^24 h等不同时程,观察Y1细胞生长形态变化,运用ELISA方法检测细胞分泌液皮质酮含量,RT-q PCR方法检测相关基因mRNA表达,Western blot方法检测相关蛋白表达。结果 1μmol·L-1FSK干预Y1细胞3 h后细胞形态开始皱缩并逐渐形成圆球状生长。与对照组比较,1μmol·L-1FSK治疗24 h后明显升高Y1细胞皮质酮水平(P<0.01);并增加类固醇急性调节蛋白酶(Star)基因和蛋白表达(P<0.01)、也明显升高皮质酮合成第一步骤限速酶Cyp11a1和皮质酮合成最后一步关键酶Cyp11b1基因表达(P<0.01)。此外,10μmol·L-1FSK干预Y1细胞15 min^12 h不同时程后,发现1 h后即可明显增加Star基因表达,并呈现典型的时效关系(P<0.01);孤儿核受体(Nr4a1和Nr4a2)基因表达在FSK处理15 min后明显升高、1 h后上调最明显(P<0.01),之后升高幅度逐渐减弱。然而,FSK对孤儿核受体(Nr5a1)和促肾上腺皮质激素受体(Mc2r)基因表达无明显影响。结论 Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞对腺苷酸环化酶激活剂佛司可林具有强烈的应答反应,佛司可林是皮质激素分泌的强有效诱导剂。

小鼠窦前卵泡二维体外培养法的优化研究

目的优化小鼠窦前卵泡二维体外培养体系,探讨卵泡刺激素(FSH)对小鼠窦前卵泡体外发育的影响。方法将分离自14 d雌鼠的初级卵泡(80~100μm)和早期次级卵泡(110~130μm)分别培养在浓度为10、100 mU/ml r-FSH的培养液中,观察并记录卵泡体外生长情况和卵母细胞的成熟情况;检测并分析第10天窦卵泡的空间生长情况及不同培养液中卵泡的雌二醇(E2)分泌水平;Western blotting检测卵泡中FSH受体(FSHR)、类固醇激素合成限速酶3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、17α-羟化酶(CYP17)及芳香化酶(CYP19)的表达水平。结果初级卵泡在10、100 mU/ml r-FSH培养液中的成腔率(0.00%±0.00%,36.14%±4.02%)及卵母细胞成熟率(0.00%±0.00%,23.54%±7.62%)明显低于早期次级卵泡成腔率(78.63%±4.13%,92.74%±2.54%)及卵母细胞成熟率(48.55%±3.73%,80.88%±4.02%),差异有统计学意义(P<0.05);在100 mU/ml r-FSH培养液中的早期次级卵泡成腔率(92.74%±2.54%)、卵母细胞成熟率(80.88%±4.02%)明显高于在10 mU/ml r-FSH培养液中的卵泡成腔率(78.63%±4.13%)及成熟率(48.55%±3.73%),差异有统计学意义(P<0.05);早期次级卵泡在10 mU/ml r-FSH的培养液中呈平铺式生长模式,而在100 mU/ml r-FSH培养液中呈立体空间生长模式,后者更接近于体内卵泡的生长模式;早期次级卵泡中FSHR的相对表达水平明显高于初级卵泡(1.86±0.32 vs.1.19±0.28,t=4.94,P<0.05)。100 mU/ml r-FSH培养液中早期次级卵泡组卵泡3b-HSD、CYP17及CYP19的表达以及E2的分泌水平明显高于用10 mU/ml r-FSH培养液培养时。结论FSH不仅会影响窦前卵泡的体外发育率,还会改变窦前卵泡的体外发育模式。选择早期次级卵泡培养在含100 mU/ml r-FSH的二维培养液中培养可获得理想的卵泡发育率及发育模式。

弓形虫感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制研究

为探究弓形虫RH株速殖子体外感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响,构建了弓形虫与小鼠睾丸间质细胞共培养试验模型。将纯化后的弓形虫虫体与细胞按照0∶1、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例共培养6 h,筛选最佳的弓形虫和细胞共培养比例。在弓形虫与细胞比例为20∶1条件下,共培养3 h、6 h、9 h和12 h,筛选最佳共培养时间。同时,使用瑞氏-吉姆萨染色液对细胞进行染色,观察共培养情况下细胞状态。培养结束,ELISA检测细胞上清的睾酮浓度,Western blot检测细胞内睾酮分泌相关蛋白StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表达水平。结果表明,弓形虫与细胞共培养6 h,当弓形虫与细胞比例高于5∶1时,睾酮分泌量显著增加(P<0.05)。弓形虫与细胞比例为20∶1时,睾酮分泌量随培养时间的延长而增加,且感染组明显高于对照组(P<0.05)。染色结果发现,弓形虫1 h内即可进入MLTC-1细胞,12 h细胞内出现大量空泡,60 h左右细胞大量破裂。Western blot结果显示,共培养12 h时,感染组CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的蛋白表达量较对照组显著降低(P<0.05)。说明弓形虫可在短时间内进入MLTC-1细胞并通过影响类固醇激素合成酶的表达来刺激睾酮的分泌,但随着时间的延长,弓形虫会抑制相关酶的表达,抑制细胞的正常功能。

脱氢表雄酮对大鼠颗粒细胞激素生成的作用

为了探讨脱氢表雄酮(DHEA)对大鼠原代卵巢颗粒细胞激素生成及相关甾体生成酶的影响,采用机械法分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞,放射免疫分析法检测培养液中雌二醇、孕酮和睾酮的含量;Real-time PCR法检测类固醇代谢途径中3β-羟基固醇脱氢酶(3β-HSD)、17β-羟基固醇脱氢酶(17β-HSD)、CYP450 mRNA的表达变化。结果显示:10μmol/L DHEA处理48 h后可显著促进大鼠原代卵巢颗粒细胞雌二醇(P<0.05)、孕酮(P<0.01)和睾酮的分泌量(P<0.01);显著促进3β-HSD(P<0.01)和17β-HSD(P<0.05)mRNA的表达,CYP450 mRNA表达略有降低,但无统计学意义。说明外源性DHEA处理可能通过调节3β-HSD、17β-HSD和CYP450等相关酶的基因表达,进而影响大鼠原代卵巢颗粒细胞雌激素和雄激素的分泌。

地黄-知母-黄柏配伍对药源性阴虚证小鼠肾上腺皮质功能的调节作用

目的研究地黄、知母、黄柏单独及配伍使用对药源性阴虚证小鼠肾上腺皮质功能的保护作用。方法 72只雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组、地黄组、知母组、黄柏组、地黄-知母-黄柏组,每组12只。采用25mg/(kg·d)氢化可的松ig给予小鼠,每日1次,连续5 d,复制药源性阴虚证模型,给药组分别ig给予地黄[9.0 g/(kg·d)]、知母[(6.0 g/(kg·d)]、黄柏[(5.0g/(kg·d)]、地黄-知母-黄柏配伍[(6.7g/(kg·d)]的水煎药液,连续给药5d。透射电子显微镜检测肾上腺皮质超微结构;ELISA检测血清皮质酮;实时荧光定量PCR技术检测肾上腺类固醇激素合成酶基因(Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1)、胆固醇摄取基因(Ldlr;Scarb1,蛋白名SRB1)、胆固醇合成限速酶基因(Hmgcr)、胆固醇储存基因(Acat1、Lipe)、胆固醇流出基因(Abca1、Abcg1)、胆固醇稳态基因(Nr1h3,蛋白名LXRα)表达变化;Westernblotting检测肾上腺LDLR、SRB1、LIPE、ACAT1、CYP11A1、StAR、LXRα蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠体质量、血清皮质酮水平均显著下降(P<0.05),肾上腺束状带细胞出现典型的脂滴融合现象、线粒体萎缩;氢化可的松显著抑制肾上腺皮质激素合成过程Star、Cyp21a1、Cyp11b1、Ldlr、Scarb1、Acat1基因表达(P<0.05),以及抑制StAR、LDLR、SBR1和LXRα蛋白表达,促进Abcg1基因表达(P<0.05)。与模型组比较,各药物治疗后肾上腺束状带细胞未见明显的脂滴融合;地黄、知母、黄柏单独治疗后显著抑制皮质酮分泌(P<0.05);地黄-知母-黄柏配伍显著提升Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Lipe、Abca1、Nr1h3基因表达(P<0.05),并增强CYP11A1、StAR、LDLR、SBR1和LXRα蛋白表达。结论地黄、知母、黄柏单独给药及其配伍治疗可通过调节胆固醇稳态平衡及恢复部分受抑制的皮质激素合成酶,配伍给药更有助于改善受损伤的肾上腺皮质功能。