卡铂短期诱导人卵巢癌类干细胞的分离及初步鉴定

目的分离卡铂耐药型人卵巢癌类干细胞,为研发和筛选针对卡铂耐药的卵巢癌二线治疗药物提供细胞模型。方法从卵巢癌组织或腹水中分离培养卵巢癌细胞,直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,分离纯化获得卵巢癌类干细胞球,采用免疫荧光法或流式细胞术检测干细胞标志物的表达。结果卵巢癌原代细胞直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养能够形成类干细胞球,并高表达干细胞标记物CD133,ALDH1,ABCG2和CD24。卡铂短期诱导分离的卵巢癌干细胞球中CD24+细胞含量明显增加。结论原代培养卵巢癌细胞经卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,能进一步富集纯化卵巢癌类干细胞,可作为卵巢癌耐药研究的理想细胞模型。

ALK2使内皮细胞转化为类干细胞的机制

内皮细胞向间充质细胞转分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)过程是血管内皮细胞转化为类干细胞的基础,持续激活状态的ALK2在EndMT过程起到关键的促进作用,EndMT发生后内皮细胞能获得类干细胞的表现型。TGF-β2和BMP4作为特异性配体激活ALK2,下调某些内皮细胞标志物并上调某些间质细胞标志物,促进EndMT过程。此外,编码ALK2的基因序列在206号氨基酸上突变形成R206H ALK2后作用类似持续激活状态ALK2,同样也能达到促进内皮细胞向间充质细胞转分化的目的。

苯妥英钠在大鼠血管内皮细胞转分化为类干细胞中的作用

目的:探讨苯妥英钠(PHT)对血管内皮细胞转分化作用的影响及其作用机制,为提高牙周组织再生能力的治疗提供思路。方法:通过transwell建立RAOEC与大鼠巨噬细胞共培养体系。研究设为空白组:基础培养基;P0组:基础培养基+100 ng/m L LPS;P25组:基础培养基+100 ng/m L LPS+25μg/m L PHT;P50组:基础培养基+100 ng/m L LPS+50μg/m L PHT,每组设3个复孔。T组:利用8 cm2培养皿单独接种RAOEC细胞,添加含有10μg/m L TGF-β1的培养基培养。Elisa检测不同处理组中TGF-β1的分泌量。RT-PCR及Western-blot,鉴定RAOEC转分化的标志CD31、α-SMA、SCF的mRNA及蛋白表达量。结果:一定浓度范围内,随着PHT浓度的升高,大鼠血管内皮细胞表型发生明显转变;ELISA检测结果显示,P0组、P25组、P50组细胞上清液TGF-β1含量分别为1.87±1.01、5.33±0.94、8.96±1.25,差异具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测结果显示,P0、P25、P50组间比较,CD31 mRNA表达量逐步降低,α-SMA与SCF mRNA表达量逐步升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Western-blot灰度分析显示,P0、P25、P50组间比较,CD31灰度值逐步降低,α-SMA与SCF灰度值逐步增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:PHT具有促进大鼠血管内皮细胞转分化的作用,为PHT应用于牙周组织再生提供了新思路。

类精子干细胞介导的遗传改造与应用

类精子干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞,仅含父源遗传物质,性染色体为 X 染 色体,能在体外自我更新、增殖和诱导分化。类精子干细胞技术结合 CRISPR/Cas9 技术,通过卵子注射可高效稳 定地获得基因型确定的半克隆小鼠。类精子干细胞介导的遗传改造具有广泛的应用前景:高效建立动物模型,快 速模拟复杂疾病,挖掘新的诊断和治疗方法;实现动物模型个体水平的靶向遗传筛选;推动基因组标签计划的规模 化实施。

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。

溶瘤腺病毒ZD55对类肝癌干细胞的抑制效应

溶瘤腺病毒能够靶向和杀死癌症干细胞,被认为是一种很有前景的抗癌药物.已有研究表明,溶瘤腺病毒ZD55能够靶向肝癌,并且表现出明显的细胞毒性效应.然而,其对肝癌干细胞是否具有同样地杀伤效力仍需进一步探讨.利用悬浮培养富集类肝癌干细胞,并验证其肝癌干细胞的特征.进一步通过MTT、结晶紫染色、Hoechst染色、Western blot和流式细胞术等检测ZD55对类肝癌干细胞的细胞存活率、凋亡诱导和病理效应等.结果发现,悬浮培养的类肝癌干细胞具有自我更新和分化能力、高表达干细胞相关转录因子(如NANOG和OCT4)、处于静息状态和具有耐药性等特性,溶瘤腺病毒处理后表现出明显的细胞毒性效应和杀伤特性,类肝癌干细胞的最低生存率仅为26.7%.ZD55能够非常明显地诱导类肝癌干细胞凋亡,其凋亡率最高达到60%.因此,ZD55可能会成为靶向肝癌干细胞的一种很有前景的治疗药物,对肝癌的临床治疗具有一定的应用价值.

兔类胚胎干细胞的体外培养

为了确立兔类胚胎干细胞(ESCs-like)体外培养方法,研究探讨了兔囊胚形成环境与饲养层细胞对内细胞团(ICM)增殖、ICM原代集落形成以及集落碱性磷酸酶(AKP)阳性率的影响,并在MEF和REF饲养层上进行了兔ESCs-like的体外培养。结果显示,去除透明带桑葚胚在体外具有较高的囊胚发育率和囊胚贴壁率(P<0.05),体外发育囊胚ICM原代集落的AKP阳性率却显著低于体内发育囊胚(P<0.05);与MEF饲养层相比,REF饲养层上ICM原代集落的形成率显著偏低(P>0.05),但原代集落的AKP阳性率却显著高于其余各组(P<0.05);MEF饲养层与REF饲养层均支持兔ESCs-like的传代培养,但F3代后MEF组中ESCs-like的集落形成率显著高于REF组(P<0.05)。

bFGF培养体系中添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/CH/bFGF培养体系添加PD或PD/hLIF后,oESC-like细胞生长较好;所有培养液中oESC-like细胞的AKP染色及多能性候选基因Sox2和Oct4免疫荧光蛋白染色结果均呈阳性;添加PD后,多能性候选基因Oct4与Klf4 mRNA的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量显著降低(P<0.01),Sox2与c-Myc升高但差异不显著。添加PD/hLIF后,Oct4的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高但不显著,Nestin和Sox2表达量降低但也不显著。以上结果表明:在oESC-like培养体系中,添加PD或PD/hLIF可能有利于维持绵羊类胚胎干细胞的多能性。

应用磁性分选方法从人脐血中分离极小类胚胎干细胞

目的建立从人脐血中分离极小类胚胎干细胞的磁性分选方法。方法脐带血标本与0.9%生理盐水以1∶1充分混匀,形成单细胞悬液层加到比重为1.077 g/mL的淋巴细胞分离液上,经密度梯度离心收集单个核细胞层。应用Lineage Cell Depletion Kit、CD45 MicroBeads、CD133 MicroBead Kit和CD34 MicroBead Kit进行磁性分选。应用流式细胞术分别检测分选的细胞群的表面标志。利用兔抗人Oct4与Nanog单克隆抗体和鼠抗兔IgG二抗分别检测分选细胞核内Oct-4和Nanog表达。RT-PCR检测分选细胞的Oct-4和Nanog mRNA表达。通过与人正常红细胞比较分析细胞大小。结果磁性分选获得Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+这2群细胞。免疫荧光法检测显示这2群细胞中均表达Oct-4和Nanog。RQ-PCR结果显示2群细胞均表达Oct-4和Nanog转录子。瑞氏染色镜下可见Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+这2群细胞大小比正常红细胞小,且核质比高。结论应用磁性分选方法可获得表达Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+的极小类胚胎干细胞。

从人脐带血中分离极小类胚胎干细胞的研究

目的极小类胚胎干细胞(very small embryonic like stem cells,VSEL SCs)具有胚胎干细胞多分化潜能特性,理论上可以分化成各种细胞,因此可以将极小类胚胎干细胞体外定向诱导形成红细胞,为了获取体外生成红细胞的新来源,本研究建立了从人脐血中分离极小类胚胎干细胞的方法。方法脐带血标本与0.9%生理盐水以1∶1充分混匀,形成单细胞悬液层加到比重为1.077g/ml的淋巴细胞分离液上,经密度梯度离心收集单个核细胞层。应用Lineage Cell Depletion Kit从单个核细胞层中分选Lin阴性细胞,用CD45Mi-croBeads从中分选CD45阴性细胞,

氯化钴通过基质金属蛋白酶增强类肺癌干细胞侵袭能力的研究

目的鉴定低氧因素在类肝癌干细胞(LCSC)侵袭和迁移中的作用,以及各种基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)在此过程中转录水平表达情况。方法采用低氧模拟剂氯化钴(CoCl_2)处理LCSC细胞,并检测其在有或无骨巨细胞瘤(GCTB)细胞趋化下的侵袭和迁移能力变化,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MMP表达。结果经CoCl_2处理的LCSC侵袭和迁移能力较未经处理对照组细胞增强,且这种效应在有GCTB细胞趋化情况下更为显著;同时,MMP-1、MMP-11、MMP-13和TIMP-1出现明显表达或表达增高,MMP-9则表达下降。结论 CoCl_2可通过影响MMP表达使LCSC侵袭能力增强,对骨相关细胞的趋化能力较单独经过CoCl_2处理,或未经CoCl_2处理而单独经GCTB细胞趋化的趋化能力明显增强。

添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出更有利于维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like cell)多能性的因子,在基础培养基N2B27/CH中,分别添加PD、PD+hLIF、PD+BPM4、PD+hLIF+BMP4,通过比较分析,初步筛选出了比本实验室原培养体系(N2B27/CH+bFGF)更利于维持oESC-like多能性的培养基添加因子。结果显示:基础培养基中添加PD、PD+hLIF后细胞生长较好,细胞之间的结合更加致密;各种培养基培养物都表达AKP与Sox2、Oct4免疫荧光蛋白等oESC-like多能性标志;4种不同培养基与bFGF相比,细胞的生长速度减慢;在基础培养基N2B27/CH中添加PD和PD+hLIF使多能性候选基因Lin28与c-Myc表达量极显著升高(P<0.01),Nestin的表达量极显著下调(P<0.01),加入PD+hLIF使Oct4表达量极显著上调(P<0.01)。因此,在oESC-like基础培养液N2B27/CH的基础上,添加PD或PD+hLIF更有利于oESC-like细胞多能性维持。

灵长类干细胞在基础科学与应用研究中的机遇与展望

以干细胞治疗为核心的再生医学为人类退行性和损伤性的重大疾病治疗提供了希望。然而,干细胞应用于人之前,一些重大的科学问题和治疗的安全性、有效性还没有得到有效的回答和验证。由于啮齿类动物在遗传、代谢和生理表型等方面与人存在较大差异,因此其研究结果较难转化到人上。非人灵长类(NHP)与人高度相似,因此,利用NHP模型可以回答和解决啮齿类动物无法回答的问题,从而解决干细胞基础科学和再生医学技术瓶颈问题。该文首先总结了在NHP模型上需解决的干细胞重大科学问题和技术瓶颈,如干细胞的多能性、治疗的安全性和效率等。其次,评述了一些新技术的出现将加速灵长类干细胞研究和应用。结合NHP模型,这些技术将促进干细胞在基础科学和临床治疗中的应用研究。最后,建议将干细胞的先进技术应用于NHP模型,这将极大促进干细胞关键科学问题的回答和技术瓶颈的解决。

类肿瘤干细胞标记物及缺氧诱导因子-1α在口腔鳞癌组织中的表达及相关性研究

目的:检测类肿瘤干细胞(cancer stem-like cell,CSC)标记物(CD44、ALDH1、NANOG)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在口腔鳞癌组织中的表达并进行相关性分析。方法:应用免疫组化法检测40例重庆医科大学附属口腔医院颌面外科手术切除的口腔鳞癌组织、10例癌旁组织、10例淋巴结转移的淋巴结组织以及10例正常淋巴结组织中CD44、ALDH1、NANOG及HIF-1α的表达,采用Fisher确切概率法及秩和检验分析这些标记物与HIF-1α之间及其与肿瘤分化程度、分期及淋巴结转移的关系。结果:(1)CD44、NANOG、HIF-1α在口腔鳞癌组织与癌旁组织中的表达差异均存在统计学意义(P_(CD44)=0.000;P_(NANOG)=0.000;P_(HIF-1α)=0.000);(2)HIF-1α与CD44在口腔鳞癌中的表达存在相关性(r_s=0.498,P=0.027);(3)CD44、ALDH1、NANOG及HIF-1α在口腔鳞癌组织中的表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移均无明显相关性。结论:CD44、NANOG、HIF-1α在口腔鳞癌组织中呈高表达,其中CD44与HIF-1α的表达具有相关性。联合检测CD44、NANOG、HIF-1α可能对口腔鳞癌早期诊断具有重要意义。

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景:以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点。而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化。目的:体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化。方法:取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定。结果与结论:形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠。免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱。RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白mRNA的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及NanogmRNA的表达减弱。说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞。

靶向Wnt信号的溶瘤腺病毒抑制肝癌干细胞研究

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大癌症并成为癌症死亡的主要原因,传统治疗早期肝癌取得了一定的进展,但是癌症的复发、转移和耐药仍未得到根本解决,这些现象可通过癌症干细胞理论(cancer stem cell,CSC)进行解释.本研究通过悬浮富集培养的方法,获得了MHCC-97H细胞的三维立体球细胞(sphere cell),并检测其干细胞特性,通过删除5型腺病毒的E1A CR2区域24 bp碱基,并用Wnt活性转录元件TCF/TEF调控E1A基因表达,同时插入抗癌基因TSLC1,得到了双靶向溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1,通过MTT、结晶紫染色实验、Hoechst、细胞划痕、蛋白质印迹技术、Transwell及免疫荧光技术检测重组病毒对肝癌类干细胞的EMT(epithelial-mesenchymal transition)转化、杀伤、凋亡以及迁移的作用.结果表明,悬浮富集培养的MHCC-97H sphere细胞具有自我更新、分化能力、静息性以及耐药性,高表达肝癌干细胞表面标志物(如CD133等),重组病毒处理后表现出明显的杀伤效果及抑制细胞迁移与侵袭的特性,靶向抑制MHCC-97H sphere细胞能力更强(P<0.001),且重组病毒能有效诱导肝癌类干细胞通过caspase途径发生凋亡.因此,重组病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1有可能成为靶向肝癌干细胞的治疗药物,具有一定的临床应用前景.

科学家利用人体皮肤细胞研制出类胚胎干细胞

据2007年11月20日《细胞》和《科学》报道，美国和日本的2个科学小组同时宣布，他们的研究人员成功地将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞相媲美的干细胞。这一成果有望使胚胎干细胞研究避开一直以来面临的伦理争议，从而大大推动与干细胞有关的疾病治疗研究。