类志贺毒素II型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。

类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)基因表达及间接ELISA方法的建立

试验针对产类志贺毒素大肠杆菌SLT-IIe初步建立一种猪水肿病大肠杆菌的血清学检测方法。通过原核表达构建出重组菌pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21在IPTG诱导下获得表达,表达产物以包涵体形式产生,使用十二烷基肌氨酸钠(SKL)变性的生化提纯步骤获取有生物学活性的重组蛋白。将提取的SLT-IIe蛋白作为抗原包被ELISA板,初步建立了特异性强的猪水肿病诊断方法,方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为2μg/孔,最佳血清稀释浓度是l∶25,HRP-羊抗猪二抗的工作浓度1∶15000,5%脱脂奶封闭lh,显色15min。该方法的建立对猪水肿病流行病学调查以及预防和控制该病的发生有重要意义。

类志贺氏菌毒素型变异体基因的克隆与鉴定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从大肠杆菌TB1中扩增出类志贺氏菌毒素型变异体(SLTe)的A亚单位基因(slteA)的960bp的编码序列和B亚单位基因(slteB)的207bp的编码序列.将这两个PCR扩增产物在EcoR和BamH位点分别克隆进pUC18质粒载体,并转化到大肠杆菌TG1中,再根据限制性内切酶酶切分析筛选到含有slteA的重组质粒p18slteA和含有slteB的重组质粒p18slteB.将重组质粒p18slteA和p18slteB进行序列分析,结果表明:这两个重组质粒中的插入序列与发表的slteA和slteB是一致的。

猪水肿病发病机理研究进展

猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理,为该病的预防和治疗提供重要的理论依据。

致猪水肿病大肠杆菌鄂E株SLT-IIeB基因的克隆、序列分析及原核表达

以湖北本地分离的致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,PCR扩增去掉信号肽和跨膜区的SLT-IIeB基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG。同时对筛选出的阳性质粒pGEX-SLT-IIeB进行测序,测序结果与Genbank上发表的12个SLT-IIeB基因序列的同源性达100%,表明该基因保守性很好。重组质粒pGEX-SLT-IIeB经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE分析表明表达产物GST-SLT-IIeB有特异性表达带,Western-blot检测证实表达产物具有免疫反应性。

规模化野猪养殖场仔猪腹泻病原菌的分离鉴定和致病性分析

从重庆某一规模化野猪养殖场腹泻仔猪的粪便棉拭子中分离到5株细菌,经形态学观察、染色特性、培养特性、生化特性分析鉴定为大肠杆菌,分别命名为CQ0401、CQ0402、CQ0403、CQ0404和CQ0405。并进行了溶血性、对Vero细胞的细胞毒性、小鼠致病性、抗药性等试验,试验结果表明:这5株大肠杆菌不产溶血素;腹腔接种小白鼠具有高致病性;抗菌谱基本一致:对菌必治(头孢三嗪)、复达欣(头孢他啶)、先锋必(头孢哌酮)敏感,尤其对菌必治敏感性最高,而对其他的药物敏感性较低或不敏感;CQ0401、CQ0403、CQ0404、CQ0405对Vero细胞均无细胞毒性,而CQ0402对Vero细胞具有较强的细胞毒性。

仔猪水肿病病原菌的分离鉴定

从江苏淮安某猪场具有典型水肿病临床症状和剖检变化的发病猪组织分离的菌株中挑选5株大肠杆菌,分别命名为JS0001、JS0002、JS0003、JS0004和JS0005。通过培养特性、菌体形态、染色特性、生化鉴定及血清学试验等一系列方法对其进行系统鉴定,并对这5株细菌进行抗药性、溶血性、Vero细胞毒性和小白鼠致病性等试验。试验结果表明,JS0001、JS0002、JS0004和JS0005表现β型溶血,腹腔接种小白鼠,JS0001、JS0002、JS0003、JS0004对其具有较高致病性;5株细菌药敏特性基本一致:对痢特灵(FR)、头孢噻肟(CTX)、阿米卡星(AN)敏感,对头孢曲松(CRO)敏感性最高,而对阿莫西林(AMX)、多西环素(DO)等药物具有耐药性。JS0002J、S0004能够分泌Vero细胞毒素,确定为产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC)。血清学试验结果表明,JS0002J、S0004的血清型为O139,JS0001J、S0003为O141。

转基因益生菌:预防肠道感染的新型微生态制剂

引起主要肠道疾病的许多致病菌能够特异性地利用宿主肠道细胞表面的各式寡糖,将其作为自身黏附或者分泌毒素的受体。因此,阻断致病菌及其分泌毒素与宿主靶细胞表面受体结合是一种可行的治疗方法。一类宿主肠道细胞表面受体基因重组益生菌在消化道内能够高效结合致病菌和所分泌的毒素,具有良好的预防肠道疾病的应用前景。本文主要以类志贺毒素受体重组益生菌为例,阐述转基因益生素的原理、技术及其疗效和潜在的问题与对策。

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在该地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%～1.84%,死亡率为0.07%～0.56%,病死率为16.0%～35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5+F411株(O93),F41+F181株(O139),F5+F41+F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离菌株对壮观霉素和新霉素高度敏感。

仔猪水肿病的诊断及综合防治

猪水肿病是由产类志贺毒素大肠杆菌引起断乳仔猪的肠毒血症,其特征为脸部、眼脸、胃壁及肠系膜部位发生水肿。是目前危害仔猪极为严重的疾病之一,主要侵害断乳前后到出售的仔猪,本病会给母猪饲养户带来严重的经济损失,对患过严重水泻的仔猪,愈后5～15天更易多见此病的发生。

SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在 p UC1 8质粒中的类志贺样毒素 II型变异体 ( SL T-IIe) A亚单位基因片段切出 ,按预定阅读框架插入到原核性表达载体 p GEX-6p-1的谷胱甘肽 S-转移酶( GST)基因的下游 ,获得重组质粒 pp GEX-A。重组质粒导入大肠杆菌 BL2 1 ,用 IPTG进行诱导表达 ,通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及 Western-blot鉴定 ,表明重组菌能大量表达融合蛋白形式的 SL T-IIe A,即 SL T-IIe A蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果 ,为进一步研究 SL T-IIe的生物学特性及研制仔猪水肿病亚单位苗提供了有效的生物材料。

某规模化奶牛场STEC和EPEC流行情况调查

本试验采用多重PCR方法对某规模化奶牛场进行了产志贺毒素类大肠杆菌(STEC)和肠致病性大肠杆菌(EPEC)流行情况调查,共检测95份粪便样品。结果显示,样品的大肠杆菌阳性率为26.32%(25/95),其中健康成母牛、腹泻成母牛、腹泻犊牛的大肠杆菌阳性率分别为23.29%(17/73)、25%(2/8)、42.86%(6/14);16份样品检出STEC,9份样品检出EPEC。

溶原转换性噬菌体的研究进展

温和性噬菌体感染菌细胞集落后,部分菌体被裂解,释放出子代噬菌体。没有裂解的菌中,噬菌体的DNA按Campbell模式整合到菌细胞的染色体中,使该部分菌溶原化,这类菌称溶原性菌株.菌株溶原化的同时获得特有的性状,即对同源的噬菌体的免疫性和可诱导性。有些温和性噬菌体使菌细胞溶原化后,菌细胞的表型发生改变,如获得或丧失某一性状,这类噬菌体称溶原转换性噬菌体。

融合基因DNA疫苗STxB-VP1和MDC-VP1对CVB3的免疫效果研究

目的构建融合基因DNA疫苗pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,并免疫小鼠,观察其免疫效果。方法从痢疾志贺菌PCR扩增志贺毒素B亚单位(STxB)基因片段,用RT-PCR法从小鼠脾细胞扩增巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)基因片段。将这两个基因片段分别与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的衣壳蛋白VP1通过一个编码15肽的柔性接头(Linker)相连接,构建真核表达质粒pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。120只BALB/c小鼠随机均分为6组,分别在胫骨前肌注射pcDNA3、pcD-NA3/STxB、pcDNA3/MDC、pcDNA3/VP1、pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,每3周1次,共3次。每次免疫后20d检测血清中中和抗体水平,最后1次免疫后20d用7LD50的CVB3进行致死性攻击,观察小鼠生存率。结果成功构建了融合基因疫苗pcD-NA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。各组小鼠的生存率分别是10%、10%、15%、40%、20%和75%,中和抗体水平及血中病毒滴度均与生存率一致。结论与pcDNA3/VP1相比,pcDNA3/MDC-VP1可诱导产生高水平的中和抗体,提高小鼠生存率,而pcDNA3/STxB-VP1仅诱导出低水平的中和抗体,小鼠的生存率降低。

中西医结合治疗仔猪水肿病

仔猪水肿病是由产类志贺毒素大肠杆菌引起的断乳后仔猪的一种肠毒血症。以眼睑、脸部、胃壁及肠系膜部位发生水肿为特征。该病在临床上较为常见，是猪以神经症状为主猪传染病中的其中一种。笔者根据临床实践摸索，对该病采取中西医结合的方法，先后治愈了多数病例．并取得了很好的治疗效果。现将该病流行特点、症状及治疗措施介绍如下，希望对大家有所帮助。

“0—157”是什么病

据《中药科技报》,自今年6月日本多所小学发生集体食物中毒事件而发现元凶为“O-157”大肠杆菌以来,至今患者多达9000多人,其中70多人死亡,数百人住院治疗,由于目前尚未彻底搞清“O-157”的传播途径和对付它的药品,致使日本人谈“O-157”色变,惶惶不安。

表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性

【目的】利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-liketoxin Escherichia coli,SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】构建表达SLT-IIeB-FedF的重组质粒,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株中构建成口服活疫苗株,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SLT-IIeB-FedF融合蛋白的表达情况,并观察重组菌体外培养的稳定性。【结果】利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌,经SDS-PAGE电泳出现了1条蛋白质量约为37kDa的蛋白条带。且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代。【结论】成功构建表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌,为发展猪水肿病-副伤寒的口服疫苗奠定了初步基础。