类泛素化蛋白酶1基因的表达与肝癌细胞株侵袭转移的关系

目的:研究类泛素化蛋白酶-1(sentrin-specific protease-1,SENP-1)基因在不同侵袭潜能肝细胞肝癌细胞株及人永生化肝细胞中mRNA和蛋白的表达水平及其与肝癌细胞侵袭能力的关系。方法:使用RT-PCR、Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光方法对肝癌细胞株MHCC97L(低侵袭性)、MHCC97H和HCCLM3(高侵袭性)、SMMC-7721和HepG2(无明显侵袭性)SENP-1 mRNA和蛋白表达水平进行检测,以人永生化肝细胞株HL-7702为对照,分析SENP-1的表达与肝癌细胞株侵袭转移能力的关系。结果:RT-PCR和Real-time PCR检测结果显示,SENP-1 mRNA(F=5.658;P=0.042)和蛋白(F=88.909,P=0.000)在肝癌细胞株中的表达随着肝癌细胞株侵袭潜能的增高而增高;Western blotting检测结果显示,5种肝癌细胞株SENP-1蛋白水平均显著高于人永生化肝细胞株;免疫荧光法观察发现,SENP-1蛋白在肝癌细胞株内主要为胞质表达,部分胞核表达。结论:SENP-1基因在肝癌细胞株中的高表达可能具有促进肝癌细胞侵袭转移的作用。

三氯乙烯致L-02细胞毒性中SET蛋白介导的组蛋白泛素化及类泛素化修饰鉴定

目的探讨SET蛋白在三氯乙烯(TCE)致肝细胞毒性中表观遗传效应的作用。方法以TCE8.0 mmol·L^(-1)分别处理L-02细胞和SET稳定低表达的L-02细胞(SET-siRNA细胞)24 h,酸法提取组蛋白后通过乙酸尿素-SDS-PAGE胶双向分离,经胶内酶解后,用液相色谱-电喷雾串联质谱定性和定量分析组蛋白泛素化及类泛素化水平。结果TCE处理的L-02细胞共鉴定出31个组蛋白赖氨酸泛素化修饰位点,32个赖氨酸类泛素化位点,其中15个泛素化位点和17个类泛素化位点与TCE致肝细胞毒性相关。经TCE处理后,L-02细胞有7个位点泛素化水平降低,8个位点泛素化水平升高;14个位点类泛素化水平降低,3个位点类泛素化水平升高。经TCE处理的SET-siRNA细胞中,SET介导了组蛋白H1和组蛋白H2B的10个位点泛素化修饰改变,同时还介导了组蛋白H2B中9个类泛素化修饰位点改变。结论TCE致L-02细胞毒性中,SET介导改变了组蛋白泛素化及类泛素化水平。

基于LightGBM的蛋白质类泛素化修饰位点预测

蛋白质类泛素化修饰位点的准确识别对基础研究和药物开发都具有重要意义。该文提出了一种基于蛋白质序列特征的类泛素化修饰位点预测模型。该模型结合氨基酸的物理化学属性统计特征和氨基酸序列二元语法模式特征,训练一种轻量型梯度提升机(Light gradient boosting machine,LightGBM)分类器预测某个蛋白质序列的类泛素化修饰位点。该文对比了不同特征的鉴别性,以及不同分类模型的预测性能。在基准数据集上的试验结果证明了该文所提方法的有效性,相比于现有方法在性能上取得了明显的提升,马修斯相关系数为91.64%。

蛋白泛素化和类泛素化修饰在植物开花时间调控中的作用

开花是植物由营养生长向生殖生长转变的关键过程,植物经过长期的演化已经进化出了精确调节开花时间的复杂网络。其中,泛素化和类泛素化作为广泛存在的蛋白质翻译后修饰形式,在植物开花时间调控过程中发挥了重要作用。本文详细介绍了泛素/26S蛋白酶体途径和类泛素化在光周期途径、春化途径、环境温度途径和赤霉素途径等各开花时间调控中的作用,为更好地理解开花途径中蛋白质翻译后修饰作用提供参考。

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli BL21,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-SUMO3的融合蛋白,并纯化获得相对分子质量为38 000的融合蛋白。结果:通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,确定了重组质粒pGEX-4T-1/SUMO3中包含有312bp的小片段,并测序鉴定该插入片段序列与SUMO3序列一致;在终浓度为0.1mmol·L-1的IPTG诱导时,GST-SUMO3的融合蛋白也被成功地表达和纯化。结论:成功地制备和纯化了类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白,为SUMO3多克隆抗体的制备提供了抗原基础,同时也为SUMO3及SUMO第二类家族功能的深入研究提供了保证。

类泛素化neddylation修饰调控乳腺癌中核纤层蛋白lamin B1的表达

背景与目的:类泛素化neddylation修饰在乳腺癌中的作用鲜有报道。该研究的前期研究发现,抑制neddylation修饰可诱导乳腺癌细胞发生衰老,但具体机制尚未完全阐明。研究报道核纤层蛋白lamin B1缺失可导致细胞衰老。本研究旨在探讨在乳腺癌中,neddylation修饰与lamin B1是否存在相关性及其可能的机制。方法:利用113例乳腺癌患者肿瘤组织制成的组织芯片对neddylation修饰过程中关键蛋白神经前体细胞表达发育下调蛋白8(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8,NEDD8)、NEDD8活化酶E1(NEDD8-activating enzyme 1,NAE1)及核纤层蛋白lamin B1进行免疫组织化学染色。采用Spearman rank分析NEDD8和NAE1与lamin B1表达的相关性。采用CRISPR/Cas9技术敲低NEDD8的表达以阻断neddylation修饰,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测neddylation修饰对Lamin B1表达的调控作用及其机制。结果:Lamin B1表达与NEDD8(r=0.817,P<0.0001)和NAE1(r=0.406,P<0.0001)表达呈显著正相关。敲低NEDD8以阻断neddylation修饰可显著抑制Lamin B1的表达。沉默P53表达可部分逆转阻断neddylation修饰对lamin B1表达的抑制。结论:Neddylation修饰与lamin B1表达呈正相关,靶向neddylation修饰可能通过P53依赖的方式抑制lamin B1的表达。这为乳腺癌的治疗提供了新的靶点和方向。

类泛素化修饰Neddylation在心血管疾病中的研究进展

迄今为止,心血管疾病被认为是威胁全世界人类健康的最常见疾病之一,不仅病死率高,而且对患者的生活质量和生存有很大影响。心血管疾病的发生和发展涉及许多环境和行为因素,而且有研究[1-2]证实许多表观遗传变异参与心血管疾病的病理生理过程。翻译后修饰是细胞内蛋白活性及表达的重要调控机制之一,是一种普遍存在于特定氨基酸残基上的化学修饰。

基于转录组测序分析人大细胞肺癌NCI-H460细胞对类泛素化抑制剂MLN4924的潜在耐药机制

目的探讨人大细胞肺癌NCI-H460细胞对类泛素化抑制剂MLN4924潜在新型耐药机制。方法利用MLN4924处理NCI-H460细胞,筛选和建立耐药细胞株。对普通NCI-H460对照细胞、MLN4924处理8 h加药细胞株、48 h加药细胞株和建立成功的耐药株进行高通量转录组测序。根据测序结果筛选差异表达基因,并进行通路富集分析。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检验。结果共构建3个NCI-H460耐药细胞株。转录组测序分析显示,与对照比较,MLN4924处理8 h加药株、处理48 h加药株、三株耐药株分别筛选出5303、4186、3388、3675和3267个差异表达基因,包括ABCA9、ABCA13、CYR61和CYP39A1等基因。RT-qRCR实验进一步验证了在瞬时加药组和耐药株中ABCA9和CYR61基因高表达。GO富集分析结果显示,差异表达基因与细胞周期、细胞凋亡、细胞间信号转导和细胞黏附等细胞生物过程高度相关,还与细胞核和细胞膜等细胞组分密切相关。KEGG通路富集分析结果显示,耐药细胞中差异表达基因集中在MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和cAMP信号通路等。结论在人大细胞肺癌NCI-H460细胞中,ABCA9、CYR61、ABCC8和CYP4F12等基因的表达变化可能会提高其对MLN4924的耐药能力。这种耐药能力可能与MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和cAMP信号通路有关。

类泛素化激活酶抑制剂PEV通过细胞衰老提高结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

细胞衰老与肿瘤细胞增殖减缓密切相关,细胞衰老抑制了许多癌基因的激活,因此诱导细胞衰老是现阶段一种干扰肿瘤细胞增殖过程的潜在策略,或许可以成为治疗肿瘤的有效途径。PEV(Pevonedistat)又称MLN4924,是NEDD8激活酶(NAE)抑制剂,可以通过阻断Cullin类泛素化使Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)失活。PEV可以抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡、细胞衰老。5-氟尿嘧啶(5-FU)是结肠癌治疗中的一线化疗药物。PEV是否可以通过促进细胞衰老增强化疗药物5-FU的敏感性,提高结肠癌的治疗效果尚未可知。该研究对结肠癌细胞HCT116、HT29分别进行PEV单药处理、5-FU单药处理以及PEV与5-FU联合处理,通过β-半乳糖苷酶染色、Western blot、细胞3天连续计数、CCK-8实验、裸鼠皮下成瘤实验、免疫组化等实验对结肠癌细胞的衰老与增殖情况进行探究。结果提示,与溶媒组相比,PEV处理组与PEV、5-FU联合处理组半乳糖苷酶活性增加,P21、P27、PAI-1、P62等衰老相关蛋白表达水平增加以及细胞核形态标志物LaminB1缺失。同时与PEV单药处理组相比,PEV、5-FU联合处理组细胞衰老程度增加,对细胞增殖的抑制效果更为显著。该研究揭示类泛素化激活酶抑制剂PEV促进细胞衰老提高结肠癌对5-FU的敏感性,从而加剧细胞衰老、抑制细胞增殖。

乙型肝炎表面抗原泛素化修饰的研究进展

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者体内存在的大量亚病毒颗粒可以诱导免疫耐受,导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持续感染.患者要实现功能性治愈的目标,则需要获得血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的消失,但目前临床上尚缺乏有效抑制HBV共价闭合环状DNA的有效药物,因此HBsAg很难被清除.蛋白质的泛素化修饰是HBsAg降解的一条潜在路径,这将有可能改变HBV的生存和免疫环境.本文重点对有关HBsAg的泛素化,包括类泛素化和去泛素化的研究进行综述,以期为CHB抗病毒治疗探索新的途径提供参考.

类泛素化蛋白酶8对T细胞活化与分化的影响

目的探讨类泛素化蛋白酶8(SENP8)在T细胞活化和分化过程中的作用。方法C57BL/6背景的Senp8基因打靶小鼠(Senp8F/F小鼠,简称WT小鼠)与同背景的Cd4⁃Cre转基因小鼠交配,获得在T细胞中特异性缺失SENP8的小鼠(Senp8F/F;Cd4⁃Cre小鼠,简称KO小鼠),通过鼠尾基因组DNA PCR以及胸腺细胞免疫印迹实验进行基因型鉴定。流式细胞术分析SENP8缺失对稳态T细胞比例和数量的影响,并以李斯特菌尾静脉注射感染WT和KO小鼠,7 d后流式细胞术分析CD8^(+)T细胞活化、扩增、效应因子表达情况。结果PCR鉴定结果揭示,KO小鼠有Cd4⁃Cre基因和纯合的Loxp片段;免疫印迹结果显示,KO小鼠胸腺细胞中的SENP8蛋白表达下降;证明成功构建了T细胞中特异性敲除SENP8的小鼠模型。流式细胞术检测结果表明,CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞在稳态WT和KO小鼠脾脏中的比例和数量并无显著差异。李斯特菌感染7 d后,条件性缺失SENP8不影响CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞数量增加和活化标志分子CD44表达,也不影响CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞中干扰素γ(IFN⁃γ)和颗粒酶B(GzmB)的表达。结论T细胞中缺失SENP8分子不影响T细胞的活化、扩增及李斯特菌感染过程中T细胞的细胞毒作用。

低氧对Jurkat细胞低氧诱导因子-1α及其类泛素化的影响及意义

目的 探讨低氧条件下Jurkat细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）类泛素化的变化对其基因转录活性和蛋白稳定性的影响,以及对下游靶基因转录活性调控的影响和意义.方法 氯化钴（CoCl2）化学缺氧法模拟肿瘤缺氧不同时间,分别用荧光定量PCR、Western blot法检测HIF-1α基因及蛋白稳定性的变化,类泛素-1（SUMO-1）、类泛素蛋酶-1（SENP-1）蛋白水平的表达,VEGF、mdr1、mdr3、Mcl-1和survivin等基因转录活性的变化.结果 在缺氧诱导4、8、16、48、72 h后,HIF-1α基因转录活性分别为缺氧诱导前的（0.79 ±0.19）、（2.65±2.05）、（4.19±4.72）、（2.77±3.37）、（0.09±0.05）、（0.69±0.55）倍（P〉0.01）,而蛋白稳定性逐渐增高后减低（P〈0.01）.SEN-1蛋白的表达与SUMO-1蛋白表达呈相反趋势,前者逐渐增高后减低,而后者逐渐减低后增高（P〈0.01）.除survivin 基因外,VEGF、mdr1、mdr3、Mcl-1基因转录水平与HIF-1α蛋白稳定性相平行.结论 缺氧引起SENP-1表达变化,通过减低HIF-1α蛋白类泛素化作用而影响HIF-1α稳定性,从而改变下游VEGF、mdr1、mdr3、Mcl-1等基因的转录活性而最终影响细胞牛物学过程.

类泛素化蛋白酶1在肝细胞肝癌组织的表达及其与侵袭和转移的关系

目的探讨类泛素化蛋白酶1（SENP-1）在人肝细胞肝癌中的表达及其与肝癌细胞侵袭转移的关系。方法应用聚合酶链式反应（PCR）和免疫组织化学方法检测肝癌组织，癌边缘组织，非癌组织中SENP-1和缺氧诱导因子-1d（HIF-la）的表达，同时检测微血管密度（MVD），使用PCR和Westernblot检测3种肝癌细胞株MHCC97H、MHCC97L和HepG2的SENP-1表达，SENPl-siRNA质粒转染基因沉默高表达SENP-1基因的肝癌细胞MHCC97H，划痕和侵袭试验检测转染前后肝癌细胞迁移和侵袭能力的变化，Westernblot检测转染前后半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase-8）、B淋巴细胞瘤2基因（bcl-2）和相关下游基因HIF-la和血管内皮生长因子（VEGF）表达变化。结果肝癌边缘组织中SENP-1、HIF-1仅的表达显著高于肝癌组织及非癌组织（P=0．000），癌边缘组织中MVD低于癌组织（P=0．000）。3种肝癌细胞株SENP-1表达均比人永生化肝细胞株高，SENP-1的表达随着肝癌细胞株侵袭转移能力的增加而增高。SENPl-siRNA质粒转染MHCC97H细胞后，促细胞凋亡蛋白Caspase-8表达升高，抑制细胞凋亡蛋白bcl-2表达降低，相关下游基因HIF-la和VEGF的表达降低。划痕试验结果显示，转染后肝癌细胞划痕距离在24h后较未处理组增加。Transwell试验结果显示，转染后肝癌细胞穿膜细胞数较未处理组明显减少（P=0．000）。结论SENP-1在人肝癌细胞肝癌中的高表达具有促进肝细胞癌侵袭转移的作用，其机制可能与SENP-1的过表达促进肝癌细胞适应缺氧微环境和抑制细胞凋亡有关。

组蛋白的类泛素化修饰与发育调控研究进展

泛素类泛素在真核生物体内广泛存在,依赖泛素化及类泛素化蛋白的翻译后修饰已经被证实参与很多细胞内的调控进程。组蛋白是染色质的主要成分之一,已经证实的组蛋白泛素类泛素翻译后修饰在基因转录、DNA损伤修复过程中起着重要作用。与组蛋白泛素化研究相比,仅发现很少的组蛋白类泛素化研究,其生理功能,特别是与其他疾病发生的联系还并不是很清楚。文章综述了组蛋白类泛素化修饰对基因转录及DNA损伤修复的调控,并展望了类泛素化修饰在发育调控中的重要作用,为组蛋白类泛素化修饰在生理功能中的研究作用提供思路。

镉对LNCaP细胞氧化应激的影响及ROS在增强去类泛素化酶SENP1表达中的作用

目的研究镉对LNCaP细胞氧化应激的影响以及活性氧(ROS)在镉诱导SENP1表达中的作用。方法取对数生长期LNCaP细胞,分别以终浓度为0、1、4和8μmol/L的氯化镉处理24 h后,采用荧光显微镜和流式细胞仪测定细胞内ROS水平,采用比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,采用Western blot检测细胞内雄激素受体(AR)、去类泛素化酶1(SENP1)、以及氧化应激相关信号通路分子和转录因子IKKα/β、HO1、AKT、ERK1/2、P38、Nrf2的表达水平,进一步对细胞核内AR、Nrf2的蛋白表达水平进行检测;用ROS清除剂NAC预处理LNCaP细胞后,再进行氯化镉处理24 h,然后采用Western blot检测细胞内SENP1表达水平。结果 LNCaP细胞在镉处理后,与对照组相比细胞内ROS水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.001),镉处理组SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.01),GSH-Px活性升高,差异有统计学意义(P<0.05);AR、SENP1、p-IKKα/β、HO1、p-AKT、p-ERK1/2和p-P38的表达水平随处理组镉剂量的增加而升高,核内AR、Nrf2蛋白表达水平也随之升高;镉可以增强SENP1的表达,而ROS清除剂预处理后,这种增强作用减弱。结论镉可能通过增加细胞内ROS水平,进一步激活AKT、ERK、P38和NF-κB信号通路,增强SENP1的表达,促进AR和Nrf2入核,从而导致前列腺癌的发生。

慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平

目的建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用。方法构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time)PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响。结果建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平。结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用。

ISG15类泛素化修饰:宿主细胞固有的抗病毒的新机制

干扰素刺激基因15(The interferon-stimulatedgene 15,ISG15)是最早被发现的类泛素蛋白。它能够通过与泛素类似的方式对底物蛋白进行翻译后修饰。对于ISG15共价修饰的生物学功能目前还知之甚少。干扰素(interferon,IFN)刺激和病毒感染均可以强烈诱导ISG15及其修饰系统的表达,暗示ISG15共价修饰在机体抗病毒固有免疫反应中发挥重要作用。本文综合近年来的研究成果,总结ISG15共价修饰对底物蛋白功能的影响,并重点讨论ISG15及其修饰在抗病毒固有免疫相关过程中的作用。

靶向小类泛素化修饰的胶质瘤治疗新策略

蛋白质的小类泛素(SUMO)化修饰(SUMOylation)是一种动态的翻译后修饰,涉及了细胞一系列的生理过程。值得注意的是,SUMO化也在多种癌症病理过程中发挥重要作用,其中包括严重危害人类健康的脑胶质瘤。本文回顾分析SUMO化修饰与胶质瘤相关的核心文献,着重探究SUMO化修饰过程中的关键靶点,可望作为胶质瘤治疗有潜力的新方法,为其精准靶向治疗提供新的策略。

基于类泛素化信号通路NEDD8靶点的药物研究进展

类泛素化是与泛素类似的蛋白质修饰系统,可通过与底物蛋白结合改变其生物化学性质。NEDD8是最重要的类泛素化蛋白之一,由于其与DNA破坏及细胞凋亡等密切相关,抑制类泛素化已被应用于多种疾病治疗中,尤其是抑制多种癌症细胞的增殖。随着对NEDD8研究的丰富,我们发现它在不同癌症中的底物蛋白及作用方式不同,同时,由于其还具有调控转录因子、调节树突状细胞反应等作用,类泛素化在多种炎症、细菌感染等疾病治疗中也可作为潜在靶点。本文对目前类泛素化信号通路NEDD8靶点的药物研究进展进行了详述。

类泛素化修饰抑制剂对人胃癌细胞增殖和迁移的影响

目的观察NEDD8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法使用不同浓度MLN4924处理人胃癌细胞株NCI-N87和SGC-7901细胞72 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测抑制率。选取20%抑制浓度(IC20)浓度处理NCI-N87和SGC-7901细胞,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果当MLN4924浓度分别达到0.528 μmol/L和0.375 μmol/L时,胃癌细胞NCI87和SGC-7901的增殖被抑制20%。CCK-8法检测结果显示,MLN4924能明显抑制胃癌细胞的增殖,且抑制作用具有剂量和时间依赖性。克隆形成实验结果表明NCI-87细胞经MLN4924作用后,克隆数低于对照组[(71.00±10.19)个比(215.33±9.56)个,P<0.01]。SGC-7901细胞经MLN4924作用后,克隆数低于对照组[(23.66±18.66)个比(132.33±34.12)个,P<0.01]。划痕实验结果显示,NCI-87细胞划痕培养48 h后,对照组细胞面积愈合率为(51.05±6.35)%,MLN4924作用后面积愈合率为(5.30±0.78)%。SGC-7901细胞划痕培养48 h后,对照组细胞面积愈合率为(23.05±2.01)%,MLN4924作用后面积愈合率为(3.12±0.52)%。结论类泛素化修饰抑制剂MLN4924可抑制人胃癌细胞的增殖和迁移。