重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂类淀粉样沉淀分析

目的利用具有天然N-末端的重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin,cC)在毕赤酵母中高效分泌表达,研究淀粉样沉淀倾向。方法通过在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33中甲醇诱导表达cC能与刚果红特异性结合特性和硫磺素T荧光分析聚积方法研究聚集的特性。结果重组cC形成的类淀粉样蛋白的聚集量有明显增加,30 d时,紫外分光光度检测,重组cC为1.21μmol/L,重组cC荧光强度由1.08增至18.05,即聚集程度增加。结论野生型cystatin C也有形成淀粉样沉淀倾向。

天然氮末端重组cC可溶性分泌表达

目的构建具有天然氮末端的重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin,cC)在毕赤酵母中高效分泌表达。方法通过设计独特的引物,利用DNA重组技术将cC的cDNA片段插入分泌型酵母表达载体pPICZαA中,构建相应的重组酵母表达质粒pPICZαA-cC,并在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33中甲醇诱导表达。结果经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、底物活性SDS-PAGE和Native-PAGE分析,随着不同剂量的β-巯基乙醇和盐酸胍组合处理重组cC,二硫键被破坏的程度加深,5 mol/L盐酸胍与10%β-巯基乙醇的组合几乎完全打开了分子内的二硫键。结论92.9%的重组cC具有二硫键并与天然cC具有相似的木瓜蛋白酶抑制活性。