蛇毒类激肽释放酶的研究进展

蛇毒丝氨酸蛋白酶是蛇毒中一类丰富的蛋白水解酶,具有重要的临床应用价值。其中一种丝氨酸蛋白酶-类激肽释放酶,作用于激肽原释放激肽,引起血管舒张,改善微循环,从而逐渐受到关注。对蛇毒中类激肽释放酶的分布、分离制备、生化性质、结构研究和药效研究等方面进行了综述,同时指出了目前存在的问题及今后的发展方向,以期为进一步的基础研究提供理论基础。

组织激肽释放酶家族在病原微生物感染中的作用

组织激肽释放酶(tissue kallikrein-related peptidase, KLK)家族是丝氨酸蛋白酶家族中一种具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶性质的蛋白水解酶亚群,有15个家族蛋白,分别为KLK1~KLK15。近年来,越来越多的研究表明,KLK家族可通过切割病毒和细菌关键蛋白、激活多种宿主受体、调控激肽系统等方式参与机体的多种生理活动,影响着病毒、细菌和真菌中多种病原微生物感染的进程,作用机制复杂且广泛。本文通过对近年来KLK家族蛋白在微生物感染中的作用和机制进行综述,以更好地探究KLK在微生物感染中的重要作用,特别是为其在结核分枝杆菌感染中的研究提供思路,也为KLK家族蛋白作为抗结核治疗靶点提供理论基础。

人类组织激肽释放酶基因14与卵巢癌研究进展

人类组织激肽释放酶14属于人类组织激肽释放酶家族中的一员,由人类组织激肽释放酶基因14编码,定位于人类染色体19q13.3-13.4上,受甾体类激素调节,其功能可能有降解胶原IV等细胞外基质作用,但具体尚不十分清楚。部分研究表明人类组织激肽释放酶基因14与卵巢癌的生长、转移和浸润有关,对卵巢癌的早期诊断、临床监测和判断预后具有一定价值。

人类组织激肽释放酶基因6与卵巢癌研究进展

人类组织激肽释放酶基因6(human tissue kallikreins gene6,KLK6)是组织激肽释放酶基因家族成员之一,位于人类染色体19q13.3-13.4上,编码人类组织激肽释放酶6(human tissue kallikreins,hK6)。近年发现hK6广泛存在于人体组织和体液中,与卵巢癌的生长、转移和浸润有关,hK6过度表达与卵巢癌患者较短存活期相关,可作为一种新的肿瘤标志物,对卵巢癌的早期诊断、临床监测和预后判断有一定价值。

激肽释放酶5、9与CA125在卵巢癌中的表达及意义

选择卵巢良性、交界性、恶性上皮性肿瘤患者共82例,术前应用免疫荧光法对血清CA125检测,对术后标本运用免疫组化SP法检测KLK5及KLK9的表达。发现KLK5及KLK9在恶性肿瘤中的阳性表达率分别为86.2%、89.3%,均高于良性及交界性肿瘤(P<0.05);KLK5的表达强度随临床分期及病理分级的升高而增强,而KLK9的表达趋势与之相反;在Ⅰ期卵巢癌中,KLK5、KLK9的阳性表达率均显著高于CA125(P<0.05)。认为KLK5及KLK9在卵巢癌中表达具有重要意义,与CA125联合测定可提高卵巢癌早期诊断的灵敏度。

卵巢癌患者血清激肽释放酶10检测的临床应用

目的:探讨卵巢癌患者血清激肽释放酶10(hK10)检测的临床价值。方法:用ELISA法测定30例卵巢癌患者、26例卵巢良性肿瘤患者及32例正常妇女血清中的hK10水平并以正常对照组95%可信区间的上限值为阳性标准,分析hK10在3组之间和卵巢癌患者不同临床分期间的水平和阳性率的差异。结果:正常对照组血清hK10水平的95%可信区间的上限值为0.846ng/mL;卵巢癌患者血清hK10水平及阳性率[(1.312±1.399)ng/mL、73.3%]显著高于卵巢良性肿瘤组[(0.508±0.236)ng/mL、7.7%]和正常对照组[(0.517±0.168)ng/mL、6.3%](t>2.89,χ2>24.5,P<0.01),而卵巢良性肿瘤组和正常对照组之间无明显差异(t=0.17,χ2=0.05;P>0.05)。Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者血清中hK10水平相比较,差异有显著性(t=1.21,P<0.05)。hK10联合CA125诊断卵巢癌的灵敏度为86.7%,特异性为87.9%,阳性预测值为78.8%,阴性预测值为92.7%,总有效率为87.5%;诊断Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌的灵敏度从hK10或CA125单指标的40%提高到60%。结论:血清hk10是一种新的卵巢癌肿瘤标志物,对卵巢癌的诊断和临床分期有较高的临床价值,hK10与CA125联合应用可提高其早期诊断的灵敏度。

人组织激肽释放酶基因对2型糖尿病大鼠血压的影响及机制

目的:探讨人组织激肽释放酶(HK)基因对2型糖尿病大鼠血压的影响及其机制。方法:高脂高糖饮食加小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病动物模型。以重组腺相关病毒为载体介导HK基因(HK组)或对照基因LacZ(LacZ组)在糖尿病大鼠体内表达,观察实验动物血压变化及离体主动脉对乙酰胆碱(Ach)依赖性血管舒张反应和一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、内皮素受体A(ETA-R)表达。结果:(1)HK组第2周开始出现血压下降,并一直持续到实验结束(12周时),而LacZ组血压无明显下降。(2)LacZ组离体主动脉对乙酰胆碱(Ach)依赖性血管舒张反应明显低于HK组。(3)HK组大鼠主动脉NO2-/NO3-浓度明显高于LacZ组,而ET-1和ETA-RmRNA明显低于LacZ组。结论:重组腺相关病毒介导HK基因表达明显降低2型糖尿病大鼠血压,改善内皮依赖性血管舒张功能,原因可能与增加动脉NO释放,减少ET-1和ETA-R的表达有关。

人腺体激肽释放酶基因重组表达载体pPICZαChK2的构建

目的 :构建人腺体激肽释放酶 (h K2 )基因的酵母表达载体。方法 :利用 RT- PCR法从人正常前列腺组织中扩增出 h K2基因 ,先将其克隆到 p GEM- T载体 ,进行序列测定和分析 ,然后将 h K2基因亚克隆至酵母p PICZαC表达载体上 ,进行鉴定。结果 :获得一个核苷酸长度为 738bp的基因 ,同源比较结果表明 ,与 Gen Bank(NCBI:AF18874 6 )公布的 h K2的基因序列有 99%的同源性 ,序列分析表明有一个氨基酸出现变异。酶切表明 h K2基因正确插入酵母表达载体 p PICZαC。结论 :成功构建出 h K2基因的酵母表达载体 p PICZαCh K2。

组织型激肽释放酶对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡和炎性反应的影响

目的探讨组织型激肽释放酶(TK)对脑缺血再灌注大鼠的治疗作用和对细胞凋亡、炎性反应的影响。方法将36只SD大鼠随机分为3组,A组:假手术;B组:生理盐水2ml·kg-1·d-1干预;C组:脑缺血再灌注后8h给予TK17.5×10-3U·kg-1·d-1治疗,每组12只。连续给药3天后分别进行神经功能缺损评分,脑梗死体积测定,梗死组织HE染色。对脑梗死组织进行TUNEL染色和细胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)、TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)免疫组织化学检测。结果与A组和B组比较,C组能明显降低神经功能缺损,使脑梗死的体积变小(P<0.05);减轻脑梗死的病理改变;使缺血区内TUNEL、caspase-3、TNF-α、IL-1阳性细胞减少(P<0.05)。结论TK对脑缺血再灌注大鼠有治疗作用,能明显减轻缺血区内的细胞凋亡和炎性反应。

人激肽释放酶重组腺相关病毒对人脐静脉内皮细胞的影响

目的:构建携带人激肽释放酶(kallikrein,KK)基因的重组腺相关病毒载体,并导入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察其对缓激肽(BK)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)水平和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:(1)将KK基因定向克隆入腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS中,构建成pAAV-KK;(2)分别将pAAV-KK及pAAV-LacZ与另外两种质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共同转染AAV-293细胞,包装出rAAV-KK和rAAV-LacZ重组腺相关病毒。将rAAV-LacZ原液稀释成不同浓度梯度并感染HT-1080细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染滴度,并观察LacZ传代HT-1080细胞的表达情况;(3)将rAAV-KK感染HUVEC,检测其对缓激肽、NO、ET-1水平和eNOS基因表达的影响。结果:(1)成功构建了带有KK目的基因的重组腺相关病毒载体和带有LacZ报告基因的重组腺相关病毒载体(对照载体);(2)rAAV-LacZ重组病毒以感染滴度6.2×107I U/ml感染HT-1080细胞后,LacZ基因能够在连续传代的HT-1080细胞内稳定持续表达;(3)与空白组、LacZ组(对照组)相比,KK感染组的HUVEC细胞培养液中BK[(2.864±1.36)pmol/ml∶(2.782±1.48)pmol/ml∶(6.576±2.08)pmol/ml]、NO[(16.42±1.02)μmol/L∶(16.46±1.25)μmol/L∶(21.28±1.46)μmol/L]水平明显增加,eNOS基因[(0.353±0.031)∶(0.364±0.049)∶(0.423±0.038)]表达明显增强,ET-1[(262.91±17.85)pg/ml∶(263.56±15.87)pg/ml∶(199.48±16.99)pg/ml]水平显著下降(P均<0.01)。结论:(1)成功构建了携带有人激肽释放酶基因的重组腺相关病毒,rAAV-KK感染体外培养的人脐静脉内皮细胞;(2)可使细胞分泌BK、NO,以及表达eNOS基因增加,ET-1减少,改善内皮细胞功能。

激肽释放酶6在成人型复发性呼吸道乳头状瘤发病机制中作用的实验研究

目的探索激肽释放酶6(kallikrein6,KLK6)在成人型复发性呼吸道乳头状瘤病(adult-onset recurrent respiratory papillomatosis,AORRP)发病中的作用,明确其对上皮细胞增殖、侵袭的影响。方法在前期基因芯片分析结果提示喉乳头瘤组织KLK6高表达的基础上,构建KLK6基因干扰慢病毒载体感染鼻咽上皮细胞,CCK8法检测细胞增殖能力,RT-PCR检测基质金属蛋白酶12(matrix metalloproteinase 12,MMP12)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,扫描电镜观察细胞形态。结果实验组细胞增殖能力较空白组、对照组减弱(F24h=983.543,F48h=3382.532,F72h=250.484,P均<0.05)。MMP12 mRNA在空白组表达量为0.984±0.038,对照组为3.816±0.091,均高于实验组0.649±0.036,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF在实验组的表达量为0.527±0.052,较空白组(0.975±0.055)和对照组(1.211±0.130)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。电镜下观察实验组细胞紧密连接数量较空白组增多。结论 KLK6可能通过同向调控MMP12、VEGF增强上皮细胞的增殖和侵袭能力,促进AORRP的发生。

人组织激肽释放酶基因6与胃癌研究进展

人组织激肽释放酶基因6(human tissue kallikreins gene 6,KLK6)是人组织激肽释放酶基因家族的重要成员,是当前研究较热的肿瘤生物学标志物之一,它位于人类19号染色体上,定位于19q13.3-13.4染色体区,编码人类组织激肽释放酶6(hk6)。近年发现hk6广泛存在于人体组织和体液中,在结肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌等消化道肿瘤组织中表达上调,并且KLK6的表达与胃癌的临床分期和淋巴结转移密切相关,可作为一种新的肿瘤标志物,对胃癌的早期诊断和预测预后有一定价值。

miR-422a靶向激肽释放酶-4抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭

目的探讨miR-422a靶向激肽释放酶-4(KLK4)对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR法(qPCR)检测人宫颈癌细胞HeLa、SiHa和人正常宫颈上皮细胞H8中miR-422a的表达;将宫颈癌HeLa细胞分为blank组、miR-NC组、miR-422a组、mut miR-422a组、miR-422a+pcDNA组、miR-422a+pcDNA-KLK4组。CCK-8实验和Transwell实验检测各组宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的能力;TargetScan软件预测miR-422a可能调控结合的靶基因,双荧光素酶活性实验对靶向关系进行验证。Western blot检测各组细胞KLK4蛋白表达水平。结果与人正常宫颈上皮细胞H8相比,宫颈癌HeLa、SiHa细胞中miR-422a呈现低表达(P<0.01),选择宫颈癌HeLa细胞进行后续实验;与miR-NC组和blank组相比,miR-422a组培养4、6 d细胞增殖能力降低,培养6、12 h细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05);与miR-422a+pcDNA组相比,miR-422a+pcDNA-KLK4组培养4、6 d细胞增殖能力明显升高,培养6、12 h细胞迁移和侵袭数量增加(P<0.01)。TargetScan软件预测发现KLK4基因与miR-422a存在结合位点,并经双荧光素酶报告基因实验验证。与miR-NC组相比,miR-422a组中KLK4蛋白的表达水平降低,与miR-422a组相比,mut miR-422a组中KLK4蛋白的表达水平升高(P<0.01),与miR-422a+pcDNA组相比,miR-422a+pcDNA-KLK4组中KLK4蛋白的表达水平升高(P<0.01)。结论miR-422a可通过靶向KLK4蛋白的表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。

组织激肽释放酶1改善大鼠心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍

目的 探讨组织激肽释放酶1(KLK1)对心脏缺血/再灌注损伤大鼠线粒体功能的影响及其机制。方法 通过KLK1重组腺病毒感染实现大鼠心脏KLK1过表达,然后采用冠状动脉左前降支结扎和再灌注的方法建立大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型,检测梗死区面积和心脏缺血危险区细胞凋亡情况;分离大鼠心脏缺血危险区心肌组织线粒体,检测线粒体功能(线粒体过氧化物生成量、线粒体膜电位、线粒体ATP生成量)。分离新生大鼠心肌细胞,通过KLK1重组腺病毒感染实现KLK1过表达,然后建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,对心肌细胞缺氧/复氧损伤模型应用缓激肽1型受体(B1R)阻断剂R715或缓激肽2型受体(B2R)阻断剂HOE140处理,利用MTT法检测细胞活力,并观察线粒体功能的变化。结果 在大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型中,KLK1过表达能减轻心肌缺血/再灌注损伤,使心肌梗死区面积减小、缺血危险区细胞凋亡减少(P均<0.01);改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,降低过氧化物生成量、增加线粒体膜电位和线粒体ATP生成量(P均<0.01)。在离体大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中,KLK1过表达能减轻心肌细胞损伤(P<0.05)、改善线粒体功能障碍(P<0.05,P<0.01),并且其作用可被B2R阻断剂HOE140抑制。结论 KLK1能改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,这可能是其具有心脏保护作用的重要机制。

缺血性心力衰竭患者沉默信息调节因子2和神经生长因子及激肽释放酶1与预后的相关性

目的研究老年缺血性心力衰竭(心衰)患者沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)、神经生长因子(NGF)和激肽释放酶1(KLK1)的作用及其与预后的相关性。方法选取2018年1月~2020年12月石河子大学医学院第一附属医院收治的240例缺血性心衰患者作为缺血性心衰组,选择同期在本院行体检的60例健康志愿者为对照组,比较2组受试者血清SIRT1、NGF和KLK1水平,所有患者均获得治疗,随访至2021年8月,失访15例,根据患者是否存活,分为存活组195例和死亡组30例,分析2组患者基线资料,行logistic回归分析及ROC曲线评估血清指标与预后的关系,以确定SIRT1、NGF和KLK1对疾病的预后预测价值。结果缺血性心衰组患者血清SIRT1水平显著低于对照组,NGF和KLK1水平显著高于对照组。死亡组患者血清SIRT1水平明显低于存活组[(893.2±56.2)ng/L vs(1128.0±63.2)ng/L,P=0.000],死亡组患者血清NGF和KLK1表达明显高于存活组[(35.0±2.2)ng/L vs(20.0±2.2)ng/L,P=0.000),(26.0±3.0)μg/L vs(17.5±2.8)μg/L,P=0.000]。多因素logistic回归分析显示,SIRT1(OR=0.403,95%CI:0.220~0.736,P=0.003)、NGF(OR=2.184,95%CI:1.410~3.381,P=0.000)和KLK1(OR=1.876,95%CI:1.272~2.765,P=0.001)是缺血性心衰患者死亡的影响因素。ROC曲线分析显示,联合诊断的敏感性为86.7%,特异性为79.0%,曲线下面积为0.898(95%CI:0.819~0.911)。结论血清SIRT1、NGF和KLK1在老年缺血性心衰患者中异常表达,且上述诸因子是患者预后死亡的影响因素。

应用磁共振技术观察人尿激肽原酶对急性脑梗死患者脑血流灌注的影响

目的应用磁共振技术观察人尿激肽原酶（尤瑞克林）对急性脑梗死患者脑梗死灶大小、脑血流等的影响，进一步阐明药物的可能作用机制。方法选取发病48h内的急性脑梗死患者41例，随机分为尤瑞克林组（23例）和丹参组（18例）。根据美国国立卫生院卒中量表（NIHSS），将患者分成轻、中、重三度。尤瑞克林组，给予0．15PNA单位尤瑞克林，丹参组给予400mg丹参，均为静脉滴注．1次／d，10d为一疗程。于治疗前及治疗后10d对患者进行头部磁共振多序列的检查。发病后30、90d采用改良Rankin量表评定患者的临床预后。结果①两组治疗后NIHSS分值，均较治疗前降低（P〈0．01）；NIHSS〉10的中、重度患者，尤瑞克林组、丹参组治疗前后NIHSS差值中位数分别为4．0（3．0～7．0），2．0（2．0～3．0），差异有统计学意义（P=0．037），尤瑞克林组对中、重度患者疗效更好；②尤瑞克林组、丹参组梗死灶增大的比率分别为42．9％（9／21）和41．2％（7／17）．差异无统计学意义（P=0．92），两组梗死灶渗血率分别为38．1％（8／21）和11．8％（2／17），差异无统计学意义（P=0．14）；③尤瑞克林组及丹参组在治疗后，梗死区局部脑血流量均较治疗前增加，差异有统计学意义（P〈0．001）；尤瑞克林组在治疗后相对局部脑血流星（梗死区脑血容量／镜像区脑血容量）增加较丹参组明显，分别为1．26±0．13和1．05±0．26，差异有统计学意义（t=2．18，P〈0．05）；④MRA显示两组患者的大血管再通比例分别为5／7和3／6，差异无统计学意义（P=0．59）。结论尤瑞克林能增加急性脑梗死患者的梗死区血液供应；与丹参组比较对中、重度患者疗效更好。

前列腺素E1联合胰激肽原酶治疗老年糖尿病下肢血管病变疗效观察

目的观察前列腺素E1（前列地尔凯时）与胰激肽原酶（怡开）联合应用治疗糖尿病下肢血管病变（PDA）疗效。方法将120例PDA患者随机分为治疗组、对照组，治疗组应用前列腺素E1联合胰激肽原酶及灯盏细辛注射液治疗，对照组单用灯盏细辛注射液治疗。共四周，观察治疗前后症状缓解情况，检测下肢血管踝肱指数（ABI）和足背动脉血流量变化。结果治疗组治疗后下肢ABI指数和足背动脉血流量较治疗前明显改善，与对照组相比较具有统计学意义。与治疗前比较，差异有统计学意义（P均〈001），结论前列腺素E1与胰激肽原酶联合应用具有改善糖尿病下肢血管病变的作用。二者均能有效改善PDA，两药联用效果更佳，是治疗PDA及糖尿病下肢血管病变的有效方法之一。

胰激肽原酶联合银杏达莫治疗早期糖尿病肾病尿白蛋白的疗效观察

目的探讨胰激肽原酶联合银杏达莫防治早期糖尿病肾病的作用。方法 60例患者随机分成治疗组和对照组,每组30例。治疗组给予胰激肽原酶240U口服,3次/d,银杏达莫注射液30ml+液0.9%氯化钠溶液250ml缓慢静脉滴注,1次/d。对照组给予胰激肽原酶240U口服,3次/d,疗程为4周;分别观察2组治疗前后尿白蛋白排泄率(UAER)、空腹血糖(FBS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血液流变学变化。结果 2组治疗前后UAER、TC、TG、全血黏度均有明显下降(P<0.01);治疗后UAER、TC、TG、全血黏度、血浆黏度、纤维蛋白原下降A组较B组明显(P<0.01)。结论胰激肽原酶联合银杏达莫治疗糖尿病肾病,除了可以降尿蛋白外,还具有降血脂,降低血液黏度,纠正血液高凝状态的作用,能有效延缓肾功能恶化。

胰激肽原酶对自发性高血压大鼠肾脏结构与功能的保护作用

目的:观察胰激肽原酶干预对自发性高血压大鼠(SHR)肾脏结构与功能的影响,探讨激肽释放酶-激肽系统在高血压及肾脏保护方面的作用。方法:12只36周龄SPF级雄性SHR随机分成2组,治疗组给予胰激肽原酶(800U/kg/d)灌胃治疗12周,观察大鼠血压、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及尿微量白蛋白(mALB)、尿β2微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)浓度及肾脏组织病理改变,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定肾皮质组织型激肽释放酶 mRNA的表达。结果:较之SHR对照组胰激肽原酶治疗后血压明显下降(P<0.01);尿mALB、β2-MG、NAG定量明显降低(P<0.01);肾皮质组织型激肽释放酶 mRNA表达水平增加(P<0.05)。病理上SHR对照组大鼠肾小球小动脉管壁增厚,管腔狭窄,个别小球硬化;胰激肽原酶治疗组肾小动脉结构正常,未见肾动脉硬化。结论:胰激肽原酶能显著减少尿微量蛋白、逆转肾小动脉硬化改变,保护肾功能,其机制可能与降低血压,增加肾脏中组织激肽释放酶水平有关。

小剂量丙咪嗪和胰激肽原酶联合治疗糖尿病痛性神经病变

目的评价小剂量丙咪嗪和胰激肽原酶联合治疗糖尿病痛性神经病变的疗效。方法采用丙咪嗪12．5mg，3次／d，疼痛症状消失的继续用药半个月，逐渐减量停用。胰激肽原酶针剂30单位加入0．9％氯化钠250—500ml液体中静滴，1次／d，连续用药两周后改为口服胰激肽原酶片120单位，3次／d维持巩固治疗，总疗程两个月。结果治疗5—7d疼痛症状消失者10例，症状减轻好转4例，无效1例。随访半年，1例疼痛症状复发，再次用药仍然有效。治疗过程中个别病例出现腹部不适、腹泻症状外，未见其他副作用。结论小剂量丙咪嗪联用胰激肽原酶治疗糖尿病痛性神经病变，镇痛作用起效快，疗效较好，无明显副作用，具有临床使用价值。