我国梅树上病毒及类病毒的检测和鉴定

目前,我国梅树上的病毒种类及发生情况仍不完全清楚。本研究从北京、武汉、南京和无锡的梅园中采集了64份疑似感染病毒的叶片样品,通过RT-PCR和斑点杂交,对7种病毒和2种类病毒进行了检测。共检测到6种病毒和1种类病毒。其中,李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)和桃潜隐花叶类病毒(peach latent mosaic viroid, PLMVd)为我国梅树上的首次检出。PNRSV、亚洲李属病毒2号(Asian prunus virus 2, APV2)、桃叶痘伴随病毒(peach leaf pitting-associated virus, PLPaV)的检出率高于30%。综合考虑病毒的分布及检出率,PLPaV、APV2、PNRSV和李树皮坏死茎痘伴随病毒(plum bark necrosis stem pitting-associated virus, PBNSPaV)是武汉、南京和无锡梅树上的主要病毒。此外,通过克隆和测序,获得了PLMVd和梅树病毒A(mume virus A, MuVA)的基因组,PLPaV的RNA1组分和PNRSV外壳蛋白(CP)基因序列。序列比较分析显示,我国PLMVd梅分离物和PNRSV梅分离物与我国桃分离物亲缘关系最近,表明PLMVd和PNRSV可能在梅和桃树间交互侵染;我国MuVA梅分离物序列与日本梅分离物序列的相似性高达98.56%;PLPaV梅分离物与我国桃分离物之间序列变异较大。上述结果不仅进一步明确了我国梅树上的病毒及类病毒种类和分布情况,而且有助于深入了解它们的流行与传播。

苹果锈果类病毒(ASSVd)的种群及遗传变异分析

苹果锈果类病毒apple scar skin viroid(ASSVd)引起苹果锈果病,是限制我国苹果生产的重要因素之一。然而,目前对ASSVd全球种群的组成及遗传变异仍缺乏足够的了解。为此,本研究对GenBank中登录的212条基因组序列进行了比较、变异分析以及系统发育分析。确认ASSVd的种群符合准种模式,由165种序列相似但不相同的变体组成。以来自我国苹果的MW315909和MW302328为代表的两种变体的数量最多,是主流变体。依据参考序列(NC001340)分析碱基变异,发现碱基变异偏好于某种碱基,并且偏好于基因组上的一些特定位点。变异不仅发生在基因组二级结构的左末端区、致病区、中央区,也发生在可变区和右末端区。值得指出的是,基因组上有4个区域极少发生变异,为保守区。其中的两个保守区(末端保守区和中央保守区)是已知的,而在可变区与右末端区交界处的两个保守区是新发现的,它们对ASSVd的复制和移动可能具有重要作用。这些结果不仅有助于掌握ASSVd的发生及流行,而且为研发RT-PCR/qPCR检测技术提供了参考,为研究ASSVd与寄主的相互作用提供了线索。

多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus,PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^(-3)~1.8×10^(-1) ng/μL。用该方法检测田间未知样品,结果与DAS-ELISA检测结果高度相符,同时PVY、PVM、PVS、PVX 4种病毒的检出率高于DAS-ELISA,表明该方法准确可靠,可用于以上马铃薯主要病毒和类病毒的快速检测。

苹果锈果类病毒RNA序列的生物信息学分析

[目的]为苹果锈果类病毒结构域功能的关系、复制机制、变异与进化的研究提供理论依据。[方法]应用生物信息学的方法,得到一系列苹果锈果类病毒的RNA序列,对比其核苷酸数目、碱基组成比例,并进行了多重系列对比及二级结构预测。[结果]来自不同地区的苹果锈果类病毒RNA和核苷酸数目分布在329～336bp。其中核苷酸数为330bp的种类占64.71%,其A的分布范围19.39%～20.61%,T的分布范围在18.79%～20.91%,G的分布范围在29.70%～30.61%,C的分布范围在30.00%～30.91%。用RNAstructure软件进行苹果锈果类病毒的二级结构预测,随着稳定能量级的逐渐增加,其碱基配对区逐渐减小,而茎环区却逐渐增加。[结论]RNA是生物生命活动不可或缺的重要生物大分子,其二级结构比一级结构具有更大的保守性。

柑桔木质陷孔病类病毒贵州分离物的分子鉴定

从采自贵州感染了啤酒花矮化类病毒(Hopstunt viroid,HSVd)的柑桔植株中抽提总核酸,通过一对鉴别引物,经RT-PCR扩增初步筛选出柑桔木质陷孔病类病毒(Citrus cachexia viroid,CCaVd)。扩增该类病毒的全长核苷酸片段,通过克隆和测序,结果发现,该片段全长298 bp,与GenBank中报道的木质陷孔病类病毒分离物同源性达到96%以上。这是中国发生的木质陷孔病类病毒的分子生物学特征的首次报道。

苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析

本研究以采自山东省栖霞市的两个苹果样品为试验材料,利用二维电泳、斑点杂交、RT-PCR等分子生物学技术对样品中的苹果锈果类病毒(ASSVd)带毒情况进行了检测。结果表明:两个样品均携带ASSVd。对两个样品中的ASSVd进行克隆测序,并利用生物学软件DNAMAN对所得序列进行分析,结果表明:与世界上首次报道的ASSVd序列(X17696)相比,本研究所得到的ASSVd序列变异较小,相对比较保守。

桃树上啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid)的检测及序列分析

2005年8月和2006年2月从中国北京、陕西、河北、山东、广西等地共采集76个无明显症状的桃树样品，经斑点杂交、RT—PCR以及生物学鉴定检测，来自北京和陕西的11个样品中检测到啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid，HSVd），总感染率达14．5％。上述3种方法检测桃树上的HSVd具有一致性。将5个样品中的HSVd进行克隆测序，得到12条不同HSVd核酸序列，与Gen Bank中D13764序列（日本桃果实HSVd分离物）同源性为93．29％～100％。可以看出，国内桃树HSVd分离物核酸序列变异比较小，地域和品种间核酸序列无明显差异。这是首次比较系统地检测中国桃树上HSVd发生情况的报道。

我国在防治马铃薯类病毒病中存在的问题及防治对策

马铃薯纺锤块茎类病毒病(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是威胁我国马铃薯生产的重要病害之一,已经给我国的马铃薯生产造成了严重影响,导致了经济损失。在防治该病害方面存在着脱除难,检测不到位,脱毒种薯质量控制体系不健全,监管力度不够等问题。今后,要加大PSTVd脱毒技术的研究,选用健康的马铃薯作为原始材料,严格执行隔离制度,完善脱毒马铃薯种薯质量控制体系,加大种薯质量监管力度等措施,控制马铃薯纺锤块茎类病毒病,确保我国马铃薯产业健康、稳定发展。

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。

NASH技术和R-PAGE技术在马铃薯类病毒检测上的应用

往复聚丙烯酰胺凝胶电泳 (R- PAGE)和核酸斑点杂交技术 (NASH)是检测马铃薯块茎类病毒(PSTVd)的主要技术 ,利用这两种方法 ,进行马铃薯脱毒试管苗的类病毒检测。结果表明 ,两种方法得到了相似的检测结果。通过试验 ,比较两种检测方法在检测灵敏度、操作性、检测量等方面的优缺点和可行性。NASH方法具有较高的灵敏性 ,适合大批量样品检测和异地取样。而 R- PAGE可区分类病毒的强弱系 ,对试验条件和技术条件要求低于

柑橘类病毒的分子鉴定与分型

【目的】检测湖南地区柑橘所携带的柑橘类病毒类型,并鉴定柑橘类病毒的亚型。【方法】以田间柑橘枝条韧皮部为试材,提取总RNA,反转录成cDNA,再用不同类型类病毒的特异引物进行PCR扩增,鉴定出各个样品所携带的柑橘类病毒类型;通过测序分析各类型的序列,并与国内外报道的序列进行同源性分析,确定所测样品的亚型。【结果】建立了CEVd、CVdII、CVdⅢ等柑橘类病毒的RT-PCR检测方法。在5个供试样品中检测出3种类型的柑橘类病毒,即柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘类病毒Ⅱ型(citrus viriodⅡ,CVdⅡ,又名hop stunt viroid,HSVd)和柑橘类病毒Ⅲ型(citrus viriodⅢ,CVdⅢ),其中CVdⅡ和CVdⅢ为国内首次发现。亚型分析表明CVdⅡ可能为新的亚型;CVdⅢ为b亚型,可能具有矮化功能。【结论】在中国鉴定出3种类型的柑橘类病毒,CEVd与国内已报道的序列完全一致,其中CVdⅡ和CVdⅢ为首次在中国发现;检测到的CVdⅡ可能为新的亚型。

马铃薯纺锤块茎类病毒RT-PCR检测及全序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM T载体上,进行全序列分析。结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上。PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础。

马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R- PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。

侵染肥城桃的病毒和类病毒的分子检测与鉴定

为明确山东肥城桃种植区桃树上主要存在的病毒和类病毒及其发生情况,采集具有花叶、斑驳和皱缩典型症状的肥城桃样品,提取叶片总RNA后,分别选用桃树上已报道的啤酒花矮化类病毒Hopstuntviroid(HSVd)、桃潜隐花叶类病毒Peach latent mosaic viroid(PLMVd)、苹果褪绿叶斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV)、樱桃锉叶病毒Cherry rasp leaf virus(CRLV)、桃花叶病毒Peach mosaic virus(PMV)、李属坏死环斑病毒Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV)、李痘病毒Plum pox virus(PPV)、李矮缩病毒Prunus dwarf virus(PDV)、樱桃绿环斑驳病毒Cherry green ring mottle virus(CGRMV)、杏假褪绿叶斑病毒Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus(APCLSV)、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒Plum bark necrosis stem pitting-associated virus(PBNSPaV)和小樱桃病毒1号Little cherry virus 1(LchV1)的特异性引物进行RT-PCR检测。PCR结果显示仅HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV的扩增产物中得到了预期大小的目的片段,将目的片段克隆测序后,经NCBI BLAST比对发现,山东肥城桃分离物HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV与GenBank已报道分离物序列一致性均达90%以上。表明山东肥城桃已感染HSVd、PLMVd 2种类病毒和ACLSV、PNRSV、PBNSPaV 3种病毒。

利用RT-PCR扩增和分析柑桔裂皮病类病毒

参考国外CEVd-A株中央保守区段(C区)和左端区段(T区),设计并合成引物Cl(-)、C2(+)、C3(+)、T1(-)、T2(+)。对感染 CEVd中国分离物的柑桔(Citrus L.)和香橼(Citrus medica L.)总核酸进行了cDNA第一链合成和PCR扩增,其中C1/C3、C1/C2分别能从感病香橼和柑桔总核酸中扩增出210bp和370bp左右的特异DNA,分别相当于CEVd的左半部和全长片段,T1/T2未能扩增出产物;健康香橼和柑桔总核酸中均未能扩增出产物。扩增结果用DIG标记的CEVd-cDNA探针进行了确证。扩增结果说明:CEVd中国分离物在左端T区与CEVd-A株存在差异。PAGE-银染法分析扩增产物表明:建立的RT-PCR方法可从约0.1ng柑桔总核酸中扩增出全长CEVd-cDNA。

新疆桃树上苹果锈果类病毒(ASSVd)的检测与全序列分析

在以往研究苹果和梨ASSVd的基础上,利用RT-PCR技术对新疆的桃树进行了检测,检测过程中首次发现桃树上有ASSVd类病毒的存在,利用RT-PCR技术分别获得了其全长序列,通过回收克隆测序,发现桃树苹果锈果类病毒基因组长为331 nt,将克隆测序结果在GenBank中登录,获得了桃树上的10条ASSVd的序列登录号为:EU031477～EU031486。为快速鉴定桃树苹果锈果类病毒奠定了良好基础。

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。

中国果树类病毒的发生及其研究进展(英文)

概述了在中国发生且己鉴定明确的5种果树类病毒,即苹果绣果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)、梨泡状溃疡类病毒(Pear blister canker viroid,PBCVd)、葡萄黄斑类病毒-1(Grapevine yellow speckle viroid-1,GYSVd-1)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和桃潜隐花叶类病毒(Peachlatent mosaic viroid,PLMVd)的研究进展,包括病害的首次发现、症状特征、发病规律、检测方法与防治对策以及这些类病毒的生物学与分子生物学特性。

生物素肼化学标记和DIG标记cDNA探针检测柑桔裂皮病类病毒

分别用生物素肼化学标记和ＤＩＧ标记我国柑桔裂皮病类病毒（ＣＥＶｄ）全长克隆ｃＤＮＡ，用以上探针对不同来源的核酸样品进行斑点杂交。两种探针可检出病柑桔总核酸的最低含量约为４００ｎｇ／斑点和８０ｎｇ／斑点；生物素肼标记ＣＥＶｄ－ｃＤＮＡ探针，可检出ＣＥＶｄ－ｃＤＮＡ的最低含量约为１０ｐｇ／斑点。研制的ＣＥＶｄ检测试剂盒能检测出发病和隐性带毒苗木中的ＣＥＶｄ，灵敏、特异、简便、快速、试剂盒已被用于检测来自我国主要裂皮病病区、湖南、湖北、福建等地的柑桔和香橼材料。