欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.0001、P <0.001、P <0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及特性分析

为获得类禽型H1N1猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）蛋白的单克隆抗体（McAb）,选取病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）,经增殖、纯化后作为免疫原,3次免疫BALB/c小鼠,取其脾与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,利用ELISA方法进行筛选,克隆得到4株杂交瘤细胞株,分别命名为5H7、2H3、2G4、8D7。4株单克隆抗体的腹水ELISA效价为1×10^9以上,HI效价高于8 log2。Western-blot试验与间接免疫荧光试验结果表明,4株McAbs均可与病毒HA蛋白发生特异性的反应。本研究将为进一步建立H1亚型SIV的相关检测方法及开展HA蛋白表位的研究奠定基础。

H1N1亚型三个谱系猪流感病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据Gen Bank中甲型、古典型和类禽型三个谱系H1N1猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的血凝素(Haemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立了H1N1亚型三个谱系SIV的RT-PCR快速鉴别诊断方法。该方法能够对甲型、古典型和类禽型三个谱系的H1N1亚型SIV做出准确诊断,扩增片段大小分别为476 bp、293 bp和997 bp。敏感性试验结果显示,该方法对三个谱系病毒的最低检测限分别为1 896拷贝/μL、1 655拷贝/μL和1 459拷贝/μL;特异性试验显示,该方法可特异性检出古典型、类禽型和甲型H1N1三个谱系的SIV,而与H5、H7和H9亚型流感病毒、猪瘟病毒及猪繁殖与呼吸不障碍综合征病毒均无交叉反应;重复性试验表明,3次重复检测结果具有良好的一致性。以上结果表明,该RT-PCR分型诊断方法的敏感性、特异性和重复性良好,为有针对性地对猪流感采取综合防控措施提供重要技术支撑,具有良好地应用前景。

H1N1亚型猪流感病毒3种谱系三重RT-PCR检测方法的建立与应用

以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)3种主要谱系2009甲型H1N1(pdm/09 H1N1)、古典型H1N1(CS H1N1)和类禽型H1N1(a H1N1)的血凝素(Hemagglution,HA)基因为靶基因,设计3对特异性引物,建立一种可以同时检测一个反应体系中H1N1亚型3种主要谱系SIV的三重RT-PCR方法,并将其应用于临床样品的检测,旨在为开展猪群中流行的H1N1亚型SIV感染及流行情况的调查研究提供有力技术支撑。结果显示,该方法可对pdm/09 H1N1、CS H1N1和a H1N1这3个不同谱系SIV特异性检出,扩增片段大小分别为476 bp、293 bp和997 bp,而与其他病毒无交叉反应;最低检测限分别为1 460拷贝/μL、1 700拷贝/μL和1 950拷贝/μL;应用到3 110份临床样品检测中,检测出10株pdm/09 H1N1和21株a H1N1 SIV,未检测到CS H1N1 SIV,与鸡胚分离病毒符合率达100%。综上,该方法敏感性和特异性良好,能快速、有效实现对临床样品中H1N1亚型3种谱系的检测。