兔类胚胎干细胞的体外培养

为了确立兔类胚胎干细胞(ESCs-like)体外培养方法,研究探讨了兔囊胚形成环境与饲养层细胞对内细胞团(ICM)增殖、ICM原代集落形成以及集落碱性磷酸酶(AKP)阳性率的影响,并在MEF和REF饲养层上进行了兔ESCs-like的体外培养。结果显示,去除透明带桑葚胚在体外具有较高的囊胚发育率和囊胚贴壁率(P<0.05),体外发育囊胚ICM原代集落的AKP阳性率却显著低于体内发育囊胚(P<0.05);与MEF饲养层相比,REF饲养层上ICM原代集落的形成率显著偏低(P>0.05),但原代集落的AKP阳性率却显著高于其余各组(P<0.05);MEF饲养层与REF饲养层均支持兔ESCs-like的传代培养,但F3代后MEF组中ESCs-like的集落形成率显著高于REF组(P<0.05)。

bFGF培养体系中添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/CH/bFGF培养体系添加PD或PD/hLIF后,oESC-like细胞生长较好;所有培养液中oESC-like细胞的AKP染色及多能性候选基因Sox2和Oct4免疫荧光蛋白染色结果均呈阳性;添加PD后,多能性候选基因Oct4与Klf4 mRNA的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量显著降低(P<0.01),Sox2与c-Myc升高但差异不显著。添加PD/hLIF后,Oct4的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高但不显著,Nestin和Sox2表达量降低但也不显著。以上结果表明:在oESC-like培养体系中,添加PD或PD/hLIF可能有利于维持绵羊类胚胎干细胞的多能性。

从人脐带血中分离极小类胚胎干细胞的研究

目的极小类胚胎干细胞(very small embryonic like stem cells,VSEL SCs)具有胚胎干细胞多分化潜能特性,理论上可以分化成各种细胞,因此可以将极小类胚胎干细胞体外定向诱导形成红细胞,为了获取体外生成红细胞的新来源,本研究建立了从人脐血中分离极小类胚胎干细胞的方法。方法脐带血标本与0.9%生理盐水以1∶1充分混匀,形成单细胞悬液层加到比重为1.077g/ml的淋巴细胞分离液上,经密度梯度离心收集单个核细胞层。应用Lineage Cell Depletion Kit从单个核细胞层中分选Lin阴性细胞,用CD45Mi-croBeads从中分选CD45阴性细胞,

应用磁性分选方法从人脐血中分离极小类胚胎干细胞

目的建立从人脐血中分离极小类胚胎干细胞的磁性分选方法。方法脐带血标本与0.9%生理盐水以1∶1充分混匀,形成单细胞悬液层加到比重为1.077 g/mL的淋巴细胞分离液上,经密度梯度离心收集单个核细胞层。应用Lineage Cell Depletion Kit、CD45 MicroBeads、CD133 MicroBead Kit和CD34 MicroBead Kit进行磁性分选。应用流式细胞术分别检测分选的细胞群的表面标志。利用兔抗人Oct4与Nanog单克隆抗体和鼠抗兔IgG二抗分别检测分选细胞核内Oct-4和Nanog表达。RT-PCR检测分选细胞的Oct-4和Nanog mRNA表达。通过与人正常红细胞比较分析细胞大小。结果磁性分选获得Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+这2群细胞。免疫荧光法检测显示这2群细胞中均表达Oct-4和Nanog。RQ-PCR结果显示2群细胞均表达Oct-4和Nanog转录子。瑞氏染色镜下可见Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+这2群细胞大小比正常红细胞小,且核质比高。结论应用磁性分选方法可获得表达Lin-CD45-CD133+和Lin-CD45-CD34+的极小类胚胎干细胞。

添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出更有利于维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like cell)多能性的因子,在基础培养基N2B27/CH中,分别添加PD、PD+hLIF、PD+BPM4、PD+hLIF+BMP4,通过比较分析,初步筛选出了比本实验室原培养体系(N2B27/CH+bFGF)更利于维持oESC-like多能性的培养基添加因子。结果显示:基础培养基中添加PD、PD+hLIF后细胞生长较好,细胞之间的结合更加致密;各种培养基培养物都表达AKP与Sox2、Oct4免疫荧光蛋白等oESC-like多能性标志;4种不同培养基与bFGF相比,细胞的生长速度减慢;在基础培养基N2B27/CH中添加PD和PD+hLIF使多能性候选基因Lin28与c-Myc表达量极显著升高(P<0.01),Nestin的表达量极显著下调(P<0.01),加入PD+hLIF使Oct4表达量极显著上调(P<0.01)。因此,在oESC-like基础培养液N2B27/CH的基础上,添加PD或PD+hLIF更有利于oESC-like细胞多能性维持。

科学家利用人体皮肤细胞研制出类胚胎干细胞

据2007年11月20日《细胞》和《科学》报道，美国和日本的2个科学小组同时宣布，他们的研究人员成功地将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞相媲美的干细胞。这一成果有望使胚胎干细胞研究避开一直以来面临的伦理争议，从而大大推动与干细胞有关的疾病治疗研究。

纤维母细胞生长因子依赖的鼠诱导性多潜能干细胞具有类胚胎干细胞多能性

近期研究表明干细胞在形态、分子以及功能上都存在两种明显特殊形式：以鼠源胚胎干细胞为代表的一类白血病抑制因子依赖性多能状态,以及鼠类外胚层干细胞为代表的纤维母细胞生长因子依赖性原始多能状态。在鼠源外胚层干细胞培养条件下诱导性多潜能干细胞的诱导取决于纤维母细胞生长因子,研究发现纤维母细胞生长因子诱导性多潜能干细胞意外地表现出类胚胎干细胞或内细胞群的性能。纤维母细胞生长因子诱导性多潜能干细胞有X染色体活性、多遗传性分化、畸胎瘤潜能以及在有机体内的嵌合能力。调查结果表明在129和B16鼠系中,无论出于何种生长因子环境下,诱导性多潜能干细胞都能保持原始多能状态。

基础培养液和小分子对猪类胚胎干细胞建系效率的影响

猪是人类疾病模型的重要候选动物之一,建立真正的猪胚胎干细胞系将极大地推动该领域的进展。培养液和细胞信号通路是目前限制猪胚胎干细胞系建立的两个主要影响因素。该研究探索了基础培养液(KO-DMEM和DMEM/F12)和小分子(PD0325901和CHIR99021,简称2i)对猪类胚胎干细胞建系效率的影响。实验结果显示,发育至6 d的体外受精胚胎在KO-DMEM培养液中贴壁率和原代克隆形成率显著高于DMEM/F12培养液;添加2i后,两种培养液中的胚胎贴壁率和原代克隆形成率均下降。在KO-DMEM培养液中可获得稳定传代的细胞系,获得的细胞系呈碱性磷酸酶阳性,核型正常,表达Oct4、Sox2和Nanog,不表达Cdx2。细胞系可成功进行转基因操作。结果表明,以KO-DMEM为基础培养液的培养体系可以获得猪类胚胎干细胞,2i不利于胚胎贴壁和原代克隆形成。该研究为猪胚胎干细胞建系培养体系的选择及推断猪胚胎干细胞多能性细胞信号调控通路提供了重要的实验依据。

人类胚胎干细胞研究应遵循伦理原则

干细胞的研究是当前生命科学的研究热点之一,提取人类的胚胎干细胞,结合现代生物医学和工程技术,有可能再造人体的各种组织和器官,从而使人类的病变或衰老的组织和器官得以修复或替代,以达到治疗癌症、糖尿病、心肌梗死、自身免疫疾病、神经退行性疾病(如帕金森病、老年性痴呆)等疑难性疾病的目的。人类胚胎干细胞,特别是克隆人类胚胎的研究所引发的伦理问题,也是当前争论的热点之一。人类胚胎干细胞研究的伦理争论焦点就在于胚胎是不是生命、是不是人,应不应该得到尊重的问题。

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。

大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响

采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。

复杂疾病小鼠模型构建新策略:类精子单倍体胚胎干细胞介导的半克隆技术

类精子单倍体胚胎干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞,仅含有父源遗传物质,性染色体为X染色体,能在体外长期自我更新、增殖或诱导分化,并可以利用CRISPR系统进行单基因或多基因的编辑,能替代精子使卵母细胞受精。区别于原核注射、卵胞质内注射获得嵌合体或利用四倍体补偿技术等传统构建基因修饰小鼠模型的方法,通过将基因编辑后的类精子单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞中,可以高效稳定地一步获得基因型确定的半克隆小鼠,不会存在嵌合现象,原代小鼠即可用于研究。基于类精子单倍体胚胎干细胞获得的多基因精准编辑的复杂疾病小鼠模型,可以在生物个体水平上阐述多个基因协同互作的效应,从而更充分地模拟复杂的、可能受多个基因影响的人类疾病的各种病理特征,以挖掘新的诊断和治疗方法。

淡水鱼类细胞的培养及其应用

一、淡水鱼类细胞已知的脊椎动物中有48%是鱼类,鱼类细胞作为组织细胞模型,应用于多门生物医学学科,是巨大的资源宝库。1962年Wolf等[1]建立了世界上第一个鱼类细胞系——虹鳟性腺细胞系（RTG-2）以来,鱼类细胞的培养手段及研究进展十分迅速。

供核细胞及处理方式对绵羊核移植效率的影响

旨在研究羔羊、胎儿成纤维细胞、绵羊类胚胎干细胞及处理方式对核移植效率的影响。比较了羔羊皮肤成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;胎儿成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;羔羊成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、类胚胎干细胞在可用率及对融合率的差异和类胚胎干细胞与转基因羔羊皮肤成纤维细胞对核移植效率的影响。结果表明,饥饿对胎儿成纤维细胞可用率影响不大(P>0.05),但平衡时间影响极大(P<0.01);饥饿及平衡时间对胎儿成纤维细胞影响都很显著(P<0.01);胎儿成纤维细胞的可用率极显著高于类胚胎干细胞和羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.01),融合率显著高于羔羊(P<0.05),但与类胚胎干细胞间没有差异(P>0.05);胚胎移植后,类胚胎干细胞的怀孕率显著高于羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.05)。饥饿和平衡时间对供核细胞的可用率有显著影响,类胚胎干细胞的核移植效果好于成纤维细胞。

绒山羊原始生殖细胞继代培养研究

本研究对原代培养至6d时的鸟巢状绒山羊类胚胎干细胞(ES细胞)集落进行了传代培养。其结果:这些集落的细胞经6代克隆传代具有胚胎干细胞的诸多特征。细胞集落有典型的鸟巢状结构,AKP染色阳性,核型分析结果染色体正常。在透射电镜下细胞体积小,核大,有多个核仁而且核仁明显,细胞形态不规则,无明显界限。细胞质中核糖体较多,内质网、线粒体发达,部分细胞的核膜上出现小泡、染色质边集而形成凋亡小体。上述结果表明该细胞具有多能性,类似ES细胞。

斑马鱼多能性因子的研究进展

哺乳动物多能性因子,主要包括Pou5f1/Oct4、Sox2、Klf4、Nanog等转录因子,不仅能够维持胚胎干细胞的未分化状态,同时也参与使分化细胞重编程回多能性状态的过程。目前对脊椎动物多能性因子在体(in vivo)功能研究报道极少。斑马鱼是研究脊椎动物早期发育分化的理想模型,它能够为多能性相关因子的功能研究提供在体环境,因而可以更准确地了解多能性因子的作用信息。近年来,已在斑马鱼中发现了多种哺乳动物多能性因子的同源基因,如oct4、nanog等。文章主要介绍了斑马鱼中多能性因子的相关研究进展,并与其它动物中的研究作一比较。