细菌类胡萝卜素裂解酶酶解虾青素工艺优化

目的:从巴氏葡萄球菌发酵液中分离纯化可降解类胡萝卜素产香的酶,优化其降解虾青素的反应,为后续鉴定产物提供依据。方法:利用高效液相色谱分析产物产量变化,应用正交试验设计,采用DPS软件进行二次多项式逐步回归分析,优化虾青素酶解反应条件。结果:类胡萝卜素裂解酶具有催化虾青素降解的活性。反应pH值、反应时间、反应温度及其交互作用对产物产量均有极显著影响(P<0.01),反应pH值和反应时间的交互作用对产物产量影响最大,其通径系数为12.726 9。利用二次多项式逐步回归得到虾青素酶解的最佳反应条件:反应pH 4.5、反应时间7 min、反应温度50℃,在此条件下虾青素产物的产量总和可达到定义条件下的1.75倍。结论:该类胡萝卜素裂解酶对虾青素降解具有很强的催化活性,得到了产物达到最大产量时的最优条件。

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质>虾青素>β-胡萝卜素>角黄质>β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al^(3+)和Fe^(3+)是该酶的强效催化剂,Fe^(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。

类胡萝卜素裂解酶催化不同底物生成非香气物质的条件及优化

利用高效液相色谱研究类胡萝卜素裂解酶催化不同底物生成的非香气物质随酶解时间、p H、温度的变化规律,结果表明非香气物质生成量会随着酶解时间的增加、p H的降低和温度的升高出现先增加后减少的趋势。另外发现β-胡萝卜素在不同反应p H下可生成不同的裂解产物。利用二次多项式逐步回归得到酶解的最佳工艺条件,β-胡萝卜素、玉米黄质、β-阿朴-8'-胡萝卜醛、角黄质和虾青素的酶解条件分别为p H4.5、温度30℃、时间15 min,p H4.5、温度30℃、时间13 min,p H4.5、温度33℃、时间45 min,p H4.0、温度30℃、时间41 min,p H4.5、温度50℃、时间7 min。按上述条件进行酶解反应,得到产物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分别为定义条件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。该方法有效提高了非香气物质的生成量,并节约了时间。

蛹虫草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆及表达分析

目的:类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶。旨在鉴定并克隆蛹虫草中的CCD酶,通过相关生物信息学分析和荧光定量PCR探究其结构、功能聚类以及表达调控。方法:用GenBank登录的CCD酶基因序列与蛹虫草基因组比对,在保守区域设计1对引物,以蛹虫草基因组的DNA为模板对CCD酶基因进行扩增,扩增产物命名为car-TC。car-TC基因连接载体后由生物公司测序;序列通过多种生物信息学软件和在线工具分析;表达量随生长情况的变化关系通过实时荧光定量PCR进行测定。结果:克隆了car-TC基因,该基因长1784bp,编码一个577aa的蛋白质,该蛋白质含有CCD酶活性必需的4个组氨酸残基,系统发育进化分析表明该蛋白和棒束菌、白僵菌的同源蛋白聚在同一簇,实时荧光定量PCR结果表明该蛋白的表达量随生长时间的延长而减少。结论:获得一个类胡萝卜素合成途径中的关键酶——双加氧裂解酶基因car-TC,该基因的表达主要受时序调控,随生活周期的进行有逐渐降低的趋势。

烟草类胡萝卜素降解关键基因CCD1的克隆与表达分析

为深入探索CCD1的功能，利用RACE方法获得了烟草品种K326类胡萝卜素降解关键基因CCD1的2个cDNA全长序列。序列分析表明，CCD1-1与CCD1-2各包含一个1635和1647bp的开放读码框（ORF），编码544和548个氨基酸。分别与林烟草和绒毛状烟草CCD1存在一个碱基的差异。CCD1-1与CCD1-2基因序列GC含量为43.24%和42.87％。预测的蛋白质分子量均为61 kDa,理论等电点（pI）6.51和6.55。与番茄和辣椒等植物的类胡萝卜素CCD1的同源性达到80％以上。跨膜区预测表明分别在138～158和142~162位氨基酸间有1个跨膜螺旋区。蛋白质二级结构分析表明，均以β折叠和无规则卷曲为主。蛋白三维结构预测分析表明CCD1-1与CCD1-2空间结构极为相似。组织表达分析表明，CCD1-1与CCD1-2在花中的表达最强，根中的表达最弱，茎和叶次之。这些结果为进一步研究类胡萝卜素降解基因的功能提供了依据。

太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶家族4成员的克隆及表达特性分析

为探讨太子参环肽成分与品质形成的分子机制,利用生物信息学方法从太子参转录组数据库中筛选出太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶(carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)新基因,并设计引物对其进行全长扩增及克隆、生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到的4条CCDs序列全长分别为1 617,1 461,1 746,1 875 bp,并根据其功能依次命名为Ph CCD1,Ph NCED2,Ph NCED3,Ph CCD4。序列分析结果表明,4个基因均含有REP65结构域,且均含有与亚铁离子结合的位点。系统进化分析表明,Ph NCED2,Ph NCED3聚为NCEDs一支,Ph CCD1,Ph CCD4聚为CCDs一支,且与拟南芥Arabidopsis thaliana的At CCDs家族相比,Ph CCD1与At CDD1同源性最高,Ph CCD4与At CCD4同源性最高,Ph NCED2,Ph NCED3与At NCED3同源性最高。实时荧光定量分析显示Ph CCD1和Ph CCD4 2个基因的表达主要在地上部分,其中Ph CCD1在叶中的表达量最高,Ph CCD4在茎叶具有高表达,可能参与太子参类胡萝卜素的生物合成;Ph NCED2和Ph NCED3 2个基因的表达主要在地下部分,其中Ph NCED2在须根中表达量最高,Ph NCED3在块根木部和皮部表达量较高,可能是脱落酸生物合成的关键酶基因。研究首次得到太子参CCDs基因,为进一步阐明太子参植株对于外界胁迫的应答机制,进而探讨太子参品质形成的生物途径奠定基础。

产CCDs酿酒酵母菌株的构建及应用研究

类胡萝卜素双加氧裂解酶(Carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)可催化类胡萝卜素氧化裂解产生降异戊二烯类香气化合物。本研究利用同源重组技术在酿酒酵母BY4741基因组LPP1位点整合了葡萄VvCCD1基因得到重组菌株QGXH1,并探明了VvCCD1酶催化裂解β-胡萝卜素的最适条件(pH7、温度40℃)及香气化合物产物(β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、二氢猕猴桃内酯等)。以‘霞多丽’葡萄为原料,将菌株QGXH1与酿酒酵母EC1118顺序接种发酵,相比于只接种EC1118,β-紫罗兰酮和β-大马士酮的含量分别提高了125%、60%。本研究为VvCCD 1基因克隆表达提供了参考,为优化葡萄酒品种香气及富含类胡萝卜素的植物资源高值化加工创造了条件。

柑橘β-柠乌素积累及其调控研究进展

色泽是果实外观品质的重要指标,类胡萝卜素是柑橘等成熟果实的特征色素,其积累影响果实外观。β-柠乌素是一种红色类胡萝卜素,在柑橘成熟果实红色色泽形成中起着重要作用。笔者从β-柠乌素物理化学特性、在柑橘中的分布、合成途径、关键基因类胡萝卜素裂解双加氧酶4(CCD4)、影响/调控积累的果实发育阶段、温度、乙烯和GA_3等内外因子等方面综述了柑橘β-柠乌素积累及其调控研究进展,并对未来研究热点作了展望,以期为增进柑橘果实色泽提供参考。