Bt抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因克隆及半定量测定

克隆了Bt-Cry1Ac抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因,并进行了半定量RT-PCR测定.定量结果显示,类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶在不同龄期棉铃虫中肠表达量存在差异,其中在5龄棉铃虫体内转录水平最高,3龄棉铃虫次之,而在4龄棉铃虫中肠内转录水平最低.此外,相同龄期的抗性品系棉铃虫体内的类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶转录水平明显高于敏感品系棉铃虫.中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的mRNA表达量的升高,可能与抗性棉铃虫对Bt杀虫蛋白的抗性演化有关.

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。

Cry2Ab及Cry1Ac杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确Cry2Ab和Cry1Ac 2种Bt杀虫蛋白单用与混用对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠主要蛋白酶活性的影响,本文测定了取食含不同Bt蛋白人工饲料后棉铃虫中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的差异。结果发现:Cry2Ab处理12 h后对棉铃虫中肠总蛋白酶影响不大;对类胰蛋白酶的影响最大,除最高浓度处理外,其他浓度处理后棉铃虫类胰蛋白酶的活性明显高于对照;但对类胰凝乳蛋白酶活性的影响呈倒"V"字型,只有6.67μg/g Cry2Ab处理后的棉铃虫酶活力显著高于对照,其他浓度处理与对照差异不显著或略低于对照;随着取食含Cry2Ab饲料时间的增加,棉铃虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加;与对照相比,处理36 h后类胰蛋白酶活性最高可增加到6.43倍。Cry1Ac处理棉铃虫12 h后总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性都明显增加,而且与处理浓度呈正相关;但是24 h后,处理后棉铃虫的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性明显降低,只有类胰蛋白酶活性仍高于对照,但活性增长倍数低于12 h时的处理。Cry2Ab和Cry1Ac 2种蛋白混用处理棉铃虫后,2种酶的酶活力基本低于Cry1Ac和Cry2Ab单用的酶活力之和;只有2种蛋白浓度均为2.22μg/g混用时,处理12 h后类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性高于2种蛋白单用时酶活力之和,且都显著的高于对照。

杠柳杀虫组分F3-28对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠消化酶活性的影响

F3-28是从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离的一个具有杀虫活性的馏分,其主要成分为杠柳苷A、杠柳苷E和杠柳苷X。为了探索F3-28的初始作用部位,为深入研究其作用机理奠定基础,本研究采用经典的昆虫消化酶活性测定方法,比较了F3-28对小地老虎Agrotis ypsilon和东方粘虫Mythimna separata5龄幼虫消化酶系活性的影响。结果表明:对F3-28不敏感的小地老虎幼虫摄食F3-28后,其中肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性无显著变化。对F3-28敏感的东方粘虫幼虫摄食F3-28后2,4,8,10,12,24,48h,其中肠总蛋白酶活性分别为对照组的0.76,2.53,1.45,1.88,1.54,1.46,1.70倍,且和药物浓度呈依赖关系;类胰蛋白酶的活性分别为对照组的1.60,1.75,1.60,1.12,1.39,1.16,1.15倍(以BAPNA为底物)或1.68,1.95,1.53,1.26,1.15,1.13,1.14倍(以TAME为底物),且和药物浓度呈依赖关系;类胰凝乳蛋白酶活性分别为对照组的0.50,1.66,1.44,1.18,1.54,1.08和1.03倍,但和药物浓度无依赖关系;淀粉酶的活性分别为对照组的1.60,1.35,1.27,1.31,1.23和1.20倍,但和药物浓度无依赖关系;对脂肪酶活性无明显影响。这些结果说明,杠柳杀虫活性组分F3-28的作用机理可能涉及对试虫中肠蛋白酶的激活,特别是对类胰蛋白酶的激活。

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^(-1)的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.