昆虫类胰岛素及其功能研究进展

胰岛素是一类生物体内在进化上非常保守的具有调控代谢、生长、发育、生殖和寿命等多种功能的肽类激素。在昆虫中,以多基因家族编码的类胰岛素为主,在结构上与脊椎动物胰岛素同源。近年来,有关昆虫类胰岛素及其信号通路等方面已有较多研究,特别是对黑腹果蝇的研究,为人类胰岛素相关疾病诊断与治疗提供了较好的试验模型。本文主要介绍昆虫类胰岛素及其受体、类胰岛素表达与释放、类胰岛素信号通路及其在调控昆虫生殖、寿命、代谢、生长与发育和翅型分化等生理功能的最新研究进展,为促进其在害虫控制或天敌保护利用等方面的应用提供参考。

类胰岛素一号增长因子微球对成骨细胞功能的影响

目的研究不同浓度类胰岛素一号增长因子(IGF-1)微球对成骨细胞功能的影响。方法缓释微球制作采用乳化冷凝聚合交联法;根据微球的药代动力学特性,将载不同浓度的IGF-1明胶微球分为0.25,2.5,25,250ng/mg组及空白对照组,通过细胞增殖和分化实验评价不同浓度IGF-1微球对成骨细胞功能的影响。结果载不同浓度IGF-1的微球对细胞增殖的影响有显著性差异,0.25,2.5,25ng/mg组对成骨细胞均具有显著的促增殖作用,其中25ng/mg组的促增殖作用最为显著。载不同浓度IGF-1的微球对细胞分化的影响有显著性差异,其中25ng/mg组的促分化作用最为显著。结论 IGF-1明胶微球有显著促进成骨细胞增殖和分化的作用,其最佳浓度为25ng/mg。

类胰岛素生长因子与肝癌

肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其病程快且预后很差.其发生是一个多因素多步骤协同的复杂过程.近来的研究报道,肝癌发生分子机制与类胰岛素生长因子体系信号通路异常相关.类胰岛素生长因子是一种多功能细胞增殖调控因子,他在胚胎发育、中枢神经系统发育及肿瘤细胞增殖等方面具有重要的生物学功能.类胰岛素生长因子的生物学活性受到包括类胰岛素生长因子不同类型的受体、类胰岛素结合蛋白及类胰岛素结合相关蛋白等多因素参与的复杂的调控网络调控.本文主要介绍了类胰岛素生长因子体系在肝癌中的异常改变、类胰岛素生长因子相关信号通路及其作用机制以及在肝癌靶向治疗中的应用.

舒林酸对高脂饲养大鼠胰岛素抵抗的影响

目的探讨舒林酸对高脂饲养肥胖大鼠胰岛素敏感性的影响以及对胰岛素靶组织受体后信号转导途径蛋白表达及其磷酸化的调节作用。方法3周龄雄性SD大鼠20只随机分组给予普通饲料(5只)、高脂饲料(15只)饲养20周,用口服葡萄糖糖耐量试验筛选胰岛素抵抗造模成功大鼠共10只,再随机分组,予高脂饲料或高脂饲料加舒林酸干预,4周后以高胰岛素正葡萄糖钳夹试验评价不同干预组大鼠胰岛素敏感性变化。Western blot观察胰岛素受体底物1(IRS1)丝氨酸(Ser)/酪氨酸(Tyr)残基磷酸化水平的状态。结果高胰岛素正糖钳夹实验表明高脂饲养组大鼠葡萄糖清除率显著下降,提示胰岛素抵抗大鼠模型成功建立。舒林酸干预组大鼠葡萄糖清除率较高脂饲养组大鼠显著上升。舒林酸干预组大鼠骨骼肌IRS1酪氨酸磷酸化表达上调,而丝氨酸磷酸化表达下降。结论舒林酸通过调节IRS1 Ser/Tyr残基的磷酸化水平,改善高脂饮食肥胖大鼠的胰岛素敏感性。

基于PI3K/AKT通路探究柚皮素改善多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗的作用机制

目的基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路,初步探究柚皮素防治大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)胰岛素抵抗的分子机制。方法SD大鼠颈背部每日皮下注射脱氢表雄酮建立PCOS模型,将造模成功的大鼠采用随机数字表法分为模型组、柚皮素组、PI3K抑制剂组、柚皮素+PI3K抑制剂组,每组15只;相同时间段取SD大鼠15只,于颈背部皮下注射油剂2 mL/kg,作为正常对照组。检测各组大鼠血糖、胰岛素、血脂、生殖激素水平,计算胰岛素抵抗指数;HE染色观察卵巢形态;免疫组化法检测磷酸化PI3K(p-PI3K)阳性表达;Western blot法检测PI3K/AKT通路磷酸化蛋白及通路相关蛋白胰岛素受体底物-1(IRS-1)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、葡萄糖转运蛋白因子-4(GLUT4)、人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因(PTEN)蛋白表达。结果与正常对照组相比,模型组大鼠卵巢组织出现卵泡囊性扩张、黄体数量及颗粒细胞层减少、闭锁卵泡增多等病理损伤症状,血脂、血糖、胰岛素水平升高,胰岛素抵抗增加,生殖激素分泌紊乱,PI3K/AKT通路磷酸化蛋白及通路相关蛋白IRS-1、GSK3β磷酸化蛋白表达、GLUT4蛋白表达降低,PTEN蛋白表达升高(P<0.05)。柚皮素可减轻卵泡囊性扩张等病理损伤,促进PI3K/AKT通路及通路相关蛋白IRS-1、GSK-3β磷酸化蛋白及GLUT4蛋白表达,改善生殖激素分泌紊乱现象,减轻胰岛素抵抗,降低血糖、血脂水平及PTEN蛋白表达(P<0.05)。PI3K抑制剂可减弱柚皮素的上述作用(P<0.05)。结论柚皮素可通过促进PI3K/AKT通路活化,降低血糖、血脂水平及胰岛素抵抗,改善PCOS大鼠生殖激素紊乱及卵巢多囊改变。

胰岛素通过Akt和Erk信号通路对甲状腺乳头状癌细胞的增殖作用

目的探讨胰岛素及其类似物通过Akt和Erk信号通路对甲状腺乳头状癌细胞(PTC-1s)的增殖作用。方法构建针对人IGF1R基因的LV-NC-GFP及RNA干扰慢病毒载体,感染PTC-1s,建立IGF1R正常表达及低表达的PTC-1s细胞模型。体外培养IGF1R正常表达及低表达PTC-1s细胞,分别设置为空白对照组、IGF1R正常表达PTC-1s细胞模型组和IGF1R低表达PTC-1s细胞模型组。通过CCK8法观察常规人胰岛素和甘精胰岛素对细胞的增殖作用,运用Western Blot法检测两种胰岛素分别干预两种PTC-1s后的IGF1R下游Akt和Erk信号通路蛋白p-Akt和p-Erk的表达。结果人胰岛素和甘精胰岛素对IGF1R正常表达的PTC-1s细胞的促细胞增殖作用呈时间依赖性,人胰岛素和甘精胰岛素相较于空白对照组,有明显的促细胞增殖作用(P<0.05)。人胰岛素和甘精胰岛素均不能促使IGF1R低表达细胞增殖,与空白对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)。人胰岛素和甘精胰岛素能促使IGF1R正常表达细胞Akt和Erk磷酸化,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。而且甘精胰岛素的促Akt磷酸化作用强于人胰岛素,人胰岛素组促Erk磷酸化作用强于甘精胰岛素组,差异均有统计学意义(P<0.05)。人胰岛素和甘精胰岛素均不能使IGF1R低表达细胞Akt和Erk磷酸化,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论人胰岛素和甘精胰岛素通过IGF1R激活Akt和Erk信号通路,促进PTC-1s细胞增殖,且甘精胰岛素的促PTC-1s细胞增殖作用强于人胰岛素。

miR-378靶向胰岛素样生长因子1类受体抑制肝癌细胞生长

目的探讨miR-378对肝癌细胞生长增殖的影响及其机制。方法用miR-378过表达慢病毒感染肝癌细胞株HepG2和稳定表达HBV的肝癌细胞株HepG2．2．15，采用四甲基偶氮唑盐和克隆形成实验研究其在肝癌发生和发展中的作用。生物信息学方法预测miR-378的靶基因，荧光素酶报告实验验证靶基因，并用实时定量PCR方法和Westernblot方法研究上调miR-378表达对其靶基因表达的影响，分析miR-378在肝癌中作用的机制。采用SPSS13．0软件进行统计分析，两组间比较采用t检验。结果与空载体感染组比较，miR-378过表达慢病毒感染组肝癌细胞的增殖活性降低和克隆形成减少，差异有统计学意义沪〈0．01或尸〈0．05）。用生物信息学方法预测胰岛素样生长因子1类受体（IGF1R）为miR-378的靶基因，荧光素酶报告实验结果显示，与对照组比，miR-378与IGF1R3’-UTR共转染组荧光酶活性下降了41．8％，差异有统计学意义（P〈0．01）。上调肝癌细胞中miR-378表达后，IGF1RmRNA表达与对照组差异无统计学意义垆〉0．05），而IGFlR蛋白表达水平显著降低垆〈0．01）。结论miR-378可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成，起抑癌基因的作用，其作用是通过抑制其下游靶基因IGF1R发挥的。HBV导致的miR-378下调表达可能是HBV相关性肝癌发生和发展的分子机制之一。

沉默胰岛素样生长因子1类受体基因对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响

目的应用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术建立稳定低表达胰岛素样生长因子1类受体（IGF1R）基因的人胰腺癌Panc-1细胞株，并观察其对吉西他滨化疗敏感性的影响。方法设计并合成3条针对IGF1R基因特异性的RNA干扰靶点，构建慢病毒pFU—GW-RNAi载体，经包装后转染293T细胞，获得病毒上清并测定其相应滴度；感染Panc-1细胞，通过实时定量聚合酶链反应（real—timePCR）鉴定RNA干扰效率；筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染人胰腺癌Panc-1细胞，获得稳定转染细胞株。噻唑蓝（MTT）比色法检测干扰IGF1R后Panc-1细胞对吉西他滨敏感性的变化。裸鼠移植瘤模型检测干扰IGF1R前后体内成瘤能力及吉西他滨对移植瘤生长的抑制作用。结果在Panc—1细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株，吉西他滨对Panc-1细胞的半数抑制剂量（IC50）从（0．774±0．001）mg／L下降到（0．330±0．003）mg／L，Panc-1细胞对吉西他滨的敏感性增加了2．35倍。裸鼠移植瘤模型中，干扰IGF1R基因后皮下种植瘤生长缓慢，联合应用吉西他滨后对肿瘤生长的抑制作用进一步增加。结论慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默IGF1R基因，能显著增强胰腺癌细胞株Panc-1对吉西他滨的敏感性。

siRNA封闭胰岛素样生长因子Ⅰ类受体对肝癌细胞侵袭能力的影响及其机制

目的探讨人胰岛素样生长因子1类受体（IGFIR）的短发夹环RNA质粒（pSUPER-siRNA—IGFIR）能否有效抑制人肝癌细胞株MHCC97H侵袭能力并探讨其相关机制。方法设计并合成靶向IGFIR的siRNA片段并构建Psuper—siRNA-IGFIR表达质粒，将其转入MHCC97H、SMMC7721细胞，通过G418筛选出稳定株。通过黏附实验、Boyden小室实验、软琼脂克隆形成实验观察各细胞株侵袭能力的变化并采用明胶酶法测定肝癌细胞的金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的含量，Western blot检测增殖相关基因的变化。并设空白对照组、阳性对照组。结果MHCC97H-IG-FIR-siRNA、SMMC7721-IGFIR-siRNA黏附能力比对照组下降约5倍（MHCC97H）和6倍左右（SMMC7721），细胞迁移能力明显下降，下降各约3倍，细胞克隆形成率明显低于对照组约6倍和8倍，其MMP-2、MMP-9、ICAM-1、LNR、E-cadherin表达比对照组低。结论构建的pSUPER-siRNA-IGFIR具有RNA干扰作用，可抑制肝癌细胞株转移能力。

阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元胰岛素受体、胰岛素受体底物-I和蛋白激酶B表达的变化

目的探索β-淀粉样蛋白（AB）寡聚体对大鼠海马神经元胰岛素受体（InsR）、胰岛素受体底物-I（IRS—I）和蛋白激酶B（PKB）表达的影响，以进一步探讨阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发病机制。方法按照完全随机化的原则应用随机数字表将实验大鼠分为3组（每组12只），采用立体定位仪下侧脑室注射的方法给模型（AD）组大鼠注射Aβ1-42寡聚体5μl，生理盐水（NS）组大鼠注射NS5μl，正常手术组大鼠只穿刺无注射。1周后重复操作1次，再过1周用Y-迷宫对大鼠行行为学检测以验证造模是否成功，然后通过免疫组织化学染色的方法观察海马组织相关蛋白的表达。结果与两对照组相比，AD组大鼠在Y-迷宫检测中出现学习和记忆障碍，表现为学习获得次数增多和记忆获得次数减少。然而，NS组和正常组大鼠行为学表现无明显差别。此外，AD组大鼠海马区神经元InsR（0．12±0．01）、IRS—I（0．14±0．02）和PKB（0．12±0．03）的表达水平也比两个对照组低（NS组：0．40±0．02、0．39±0．06、0．38±0．03，均数差异为-0．13、-0．13、-0．17；正常手术组：0．38±O．07、0．35±0．03、0．35±0．06，均数差异为-0．15、-0．07、-0．73；均P〈0．05），表现为免疫组织化学染色平均吸光度值降低。结论Aβ。寡聚体引起的大鼠学习记忆功能障碍可能是由AB介导的海马神经元胰岛素信号转导通路发生紊乱，从而使相关蛋白表达降低所导致。

梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤成熟人神经母细胞瘤细胞的修复作用及其机制

目的观察梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(SH-SY5Y细胞)的修复作用,并探讨其作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、诱导组、模型组、梓醇组。对照组:SH-SY5Y细胞不做任何处理;诱导组:用ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h,将其诱导为成熟神经元;模型组:ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h后,将完全培养基换成无糖的EBSS溶液置于三气培养箱(氧气1%,二氧化碳5%,氮气94%)4 h,氧糖剥夺结束后换回完全培养基(含糖),复氧12 h;梓醇组:细胞经模型组同样处理后,加入含不同浓度梓醇(50、100、200μmol/L)的完全培养基常规培养72 h。采用CCK-8法检测各组细胞的活力;细胞划痕实验观察细胞的迁移、穿越能力;β-Ⅲ-tubulin免疫荧光染色标记轴突,并测量其长度;Western blotting法检测细胞中神经生长相关蛋白(GAP43)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化的胰岛素生长因子1受体(p-IGFR)、抑癌基因(PTEN)、雷帕霉素分子靶点(mTOR)、磷酸化核糖体S6蛋白(p-S6)。结果与对照组相比,诱导组存活率升高(P<0.0001);与诱导组相比,模型组存活率降低(P<0.0001);不同浓度梓醇组存活率均有升高(P均<0.05),各浓度组之间比较,P>0.05。对照组细胞胞体圆润,轴突较短,胞体与胞体之间几乎没有轴突连接;诱导组细胞轴突较长并且相互交织,形成神经网络;与诱导组相比,模型组数量减少,胞体扁平,轴突回缩;与模型组比较,梓醇组神经元数量增多,轴突长度获得一定的恢复;与空白对照组相比,诱导组轴突长度延长;与诱导组相比,模型组轴突长度缩短(P<0.001);不同浓度梓醇组神经元轴突长度均延长(P均<0.01),而不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与模型组相比,不同浓度梓醇组48 h后的划痕面积均小(P均<0.05),不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与诱导组比较,模型组PTEN相对表达量升高(P<0.05),OPN降低(P<0.05);与模型组比较,不同浓度梓醇组GAP43、OPN、p-IGFR、mTOR及p-S6蛋白相对表达量均升高,PTEN蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞具有修复作用,其作用机制可能是通过上调OPN表达,诱导细胞表面IGFR受体磷酸化成为p-IGFR,进而激活mTOR通路,同时降低PTEN的表达以减轻其对mTOR通路的抑制作用,使细胞内在生长能力被充分启动,从而达到促进神经细胞迁移、轴突发芽和生长的作用。50、100、200μmol/L梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞修复作用相当。

蛋用鹌鹑IGF-1R基因的多态性与体尺性状相关性分析

类胰岛素生长因子1型受体(IGF-1R)基因是类胰岛素生长因子(IGFs)在生物体内发挥作用的主要效应器,对机体生长发育进程中有重要影响。为探讨IGF-1R基因多态性与蛋用鹌鹑体尺性状的相关性,采用PCR产物直接测序方法对中国黄羽鹌鹑、北京白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑3种蛋用鹌鹑的IGF-1R基因进行多态性分析,并对IGF-1R基因的多态性与鹌鹑体尺性状进行相关性分析。结果表明,在3个蛋用鹌鹑群体中检测到IGF-1R基因A57G和A72T两个突变位点,A57G位点发生了A/G碱基突变,有AA、AG和GG三种基因型;A72T位点发生了A/T碱基突变,有AA、AT和TT三种基因型。中国黄羽鹌鹑的A57G位点对胫长、胸骨长和胫围有显著影响(P<0.05),A72T位点对体质量和胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAA对体质量有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAA对胫长、胸骨长、胫围有明显影响(P<0.05)。北京白羽鹌鹑的A57G位点对体质量、胫长、体长、胫围有显著影响(P<0.05),A72T位点对胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAA对体质量和胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAT、GGAA、GGAT对胫长有显著影响(P<0.05),组合基因型GGAA对胸深有显著影响(P<0.05)。朝鲜鹌鹑的A57G位点对体质量有显著影响(P<0.05),A72T位点对胸骨长和胫围有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAA对体质量有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAT对胫长和胸宽有显著影响(P<0.05)。因此,IGF-1R基因可以作为候选基因应用于蛋用鹌鹑体尺性状的分子标记辅助选择。

RNA干扰沉默IGF-Ⅰ R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子类受体(IGF-Ⅰ R)表达的阻断效应,和IGF-Ⅰ R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变。方法:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-Ⅰ R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-Ⅰ R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化。结果:IGF-Ⅰ R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24h、48h、72h的IC50均明显减少,IGF-Ⅰ R siRNA1组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77mg/L,0.5mg/L DDP联合IGF-Ⅰ R siRNA1作用48h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%。结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-Ⅰ R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加。

靶向IGF1R的siRNA抑制人肝癌细胞SMMC7721裸鼠移植瘤的实验研究

背景与目的:利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法。本研究探讨人胰岛素样生长因子1类受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)的短发夹环RNA对人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤的抑制作用。方法:设计并合成特异性靶向IGF1R的siRNA片段,构建SMMC7721-IGF1R-siRNA表达质粒,将其转入SMMC7721细胞。通过G418筛选出稳定株,移植裸鼠成瘤。同时设立对照组。根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线,以HE染色法观察质粒处理后瘤组织的病理改变,Westernblot检测肿瘤组织中IGF1R的表达变化,免疫组化SP法检测检测瘤组织内微血管密度,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果:SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤体积与SMMC7721-IGF1R-mutation组、SMMC7721组相比差异有统计学意义(P<0.05)。病理学检查及TUNEL检测发现,SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞凋亡指数[(50.2±6.4)%]明显高于SMMC7721-IGF1R-mutation组[(5.4±1.0)%]和SMMC7721组[(6.0±2.1)%](P<0.05)。SMMC7721-IGF1R-siRNA组与SMMC7721-IGF1R-mutation组、SMMC7721相比,瘤内IGFIR蛋白表达明显下调。SMMC7721-IGF1R-siRNA组微血管密度(11.3±4.4)与SMMC7721-IGF1R-mutation组(36.7±7.6)、SMMC7721组(28.4±6.5)相比明显下降(P<0.05)。结论:构建的SMMC7721-IGF1R-siRNA具有RNA干扰作用,能抑制SMMC7721细胞裸鼠移植瘤的生长。

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。

慢病毒介导的双干扰RNA同时沉默IGF1R和EGFR蛋白治疗肝癌的实验研究

目的研究双靶向IGF1R和EGFR基因的小干扰RNA(si RNA)慢病毒对肝癌细胞SMMC7721中IGF1R和EGFR表达的影响及其对细胞生长的作用。方法针对已经筛选确定的IGF1R和EGFR基因干扰有效序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与pLVTHM载体连接产生pLVTHM-IGF1R。RT-PCR合成含H1启动子EGFR-si RNA表达框,克隆入pLVTHM-IGF1R中形成pLVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA。用pLVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA、psPAX2和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒LVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA,大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。用LVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA感染SMMC7721细胞(感染组),以未经处理的SMMC7721细胞(细胞对照组)及空载体质粒LVTHM(空载体对照组)作为对照。RT-PCR及Western blot法检测细胞中IGF1R和EGFR的表达,Cell Counting Kit-8法检测细胞生长,TUNEL法检测细胞凋亡。结果成功构建慢病毒LVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA;病毒滴度为4.58×109pfu/ml;LVTHM-IGF1R-EGFR-si RNA明显抑制肝癌细胞中IGF1R和EGFR的mRNA和蛋白的表达,分别为细胞对照组及空载体对照组的5%、4%和4%、3%以及10%、11%和8%、9%(P<0.05),同时能抑制肝癌细胞生长(P<0.05),促进肝癌细胞凋亡(P<0.05)。结论靶向IGF1R和EGFR基因siRNA慢病毒可同时有效封闭肝癌细胞中的IGF1R及EGFR,降低肝癌细胞的增殖能力,为以IGF1R和EGFR基因为靶点的肝癌生物治疗奠定了理论基础。

靶向IGFIR的siRNA抑制人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的探讨人胰岛素样生长因子1类受体(IGFIR)干扰质粒(PSUPER-siRNA-IGFIR)对人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将PSUPER-siRNA-IGFIR质粒转染入移植瘤中,观察对肿瘤生长的作用。结果PSUPER-siRNA-IGFIR对人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤有生长抑制作用。与对照组相比IGFIR和MVD的表达明显下降。结论PSUPER-siRNA-IGFIR能抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长。

Survivin-pPRIME-IGF1R-miR30慢病毒载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制

目的:探讨survivin启动子调控的重组慢病毒survivin-pPRIME-IGF1R-miR30载体(简写为sur-IGF1R-miR30)对肝癌Hep3B细胞IGF1R表达和细胞生长的影响。方法:PCR扩增survivin启动子,构建sur-pPRIME;将针对IGF1R基因的干扰序列与sur-pPRIME载体连接,构建sur-IGF1R-miR30慢病毒载体。将sur-IGF1R-miR30、psPAX2和pMD2G质粒共转染293T细胞,扩增慢病毒,检测病毒滴度。以sur-IGF1R-miR30感染人肝癌Hep3B细胞和胎肝L-02细胞,RT-PCR、Western blotting检测Hep3B细胞IGF1R的表达,CCK-8法检测Hep3B细胞的生长。结果:成功构建survivin启动子调控的慢病毒载体sur-IGF1R-miR30,滴度为4.58×109PFU/ml。Sur-IGF1R-miR30感染后,Hep3B细胞中特异表达荧光蛋白,L-02细胞中基本没有表达。Sur-IGF1R-miR30感染Hep3B细胞可阻断IGF1RmRNA和IGF1R蛋白的表达。Sur-IGF1R-miR30感染抑制肝癌细胞的生长,第7天时的抑制率达60%(P<0.05)。结论:成功构建的重组慢病毒载体sur-IGF1R-miR30可有效地降低肝癌细胞中IGF1R的表达,抑制肝癌细胞的增殖。

AFP介导慢病毒载体治疗荷人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的构建甲胎蛋白(AFP)介导的以沉默胰岛素样生长因子1型受体(IGF1R)和表达野生型p53(Wtp53)的重组慢病毒,探讨该慢病毒载体对肝癌干细胞CD45^-CD90^+双靶点基因系统(IGF1R和Wtp53)和对体内肝癌生长的抑制作用。方法从肝癌细胞Hep3B系中分离出肝癌干细胞CD45^-CD90^+细胞亚群,用携带AFP-Wtp53-pPRIME-miR30-shRNAIGF1R融合基因的慢病毒进行体外转染。利用RT-PCR和Western blotting检测IGF1R、Wt P53在细胞内的表达,将荷人肝癌的移植瘤裸鼠随机分为空白对照组(腋下接种未感染任何病毒的CD45^-CD90^+细胞)、空载体对照组(腋下接种感染空载体慢病毒pPRIME的CD45^-CD90^+细胞)和实验组(腋下接种感染空载体慢病毒AFP-Wt P53-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的CD45^-CD90^+细胞),检测各组的IGF1R表达,微血管密度和细胞凋亡程度。结果成功构建anti-AFP介导的慢病毒;qRT-PCR和Western blotting检测显示,anti-AFP介导的慢病毒能表达Wtp53并同时干扰IGF1R的表达。体内实验显示,与空白对照组和空载体对照组相比,实验组肿瘤的潜伏期较长,肿瘤体积较小,瘤组织的IGF1R水平、微血管密度较低,但凋亡指数较高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 anti-AFP介导的慢病毒可高效特异性转染肝癌干细胞CD45^-CD90^+双靶点基因系统,起到杀伤肝癌干细胞及抑制肝癌体内生长的作用。

Rab蛋白调控葡萄糖转运蛋白4转运机制的研究进展

胰岛素通过刺激葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的转运调节脂肪细胞和肌细胞摄取葡萄糖,维持机体内的血糖平衡。Rab蛋白是GTP结合蛋白。近几年研究表明,Rab蛋白是影响GLUT4转运到细胞膜的重要调控因子,参与GLUT4囊泡的形成转运以及融合等过程。本文综述了几种不同的Rab蛋白以及Rab蛋白的GTP酶激活蛋白即分子质量160 ku蛋白激酶B底物蛋白(AS160)对于GLUT4转运的调控机制。对Rab蛋白调控GLUT4转运机制的研究,有助于解释2型糖尿病的胰岛素耐受机制,并可为糖尿病治疗提供新的方向。