凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析

类胰岛素肽(ILP)是胰岛素超家族的成员,具有进化保守性,是影响动物生命活动的重要因子之一。本研究克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ILP1(Lv ILP1)全长基因,m RNA长度为812 bp,其中开放阅读框长543 bp,编码180个氨基酸。序列分析显示,Lv ILP1蛋白预计分子量为20.81 kDa,理论等电点为9.45,不稳定系数为96.20,具有一个信号肽,没有跨膜结构,推导其为碱性、不稳定的分泌蛋白。结构预测显示,该蛋白具有胰岛素超家族保守的Il GF结构域,由N端信号肽、B链、C肽和A链组成,同时具有6个保守的半胱氨酸位点和2个断裂位点。系统进化分析显示,Lv ILP1与斑节对虾(Penaeus monodon)ILP7亲缘关系最近,与甲壳动物ILP1聚为一支,然后分别与无脊椎动物ILP7、脊椎动物松弛素(Relaxin)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因子(IGF)聚在一起。无脊椎动物ILP7类与外群海葵(Actinia tenebrosa)ILP的进化关系最近,表明这类ILP可能与胰岛素超家族的祖先较为相似。转录因子预测显示,Lv ILP1可能的转录因子为叉头框蛋白O3(FoxO3)、糖皮质激素受体(GR)、CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(STAT)等;蛋白互作分析显示,Lv ILP1与细胞膜上的胰岛素受体(IR)、神经信号分子(VGLUT1、SYT 1_3)、糖蛋白激素(GPHB5)、鞣化激素(Bursicon)等相互作用;对这些转录因子和互作蛋白的生物功能进行分析,进而推测Lv ILP1可能具有调节生长发育、激素刺激反应、神经系统稳态、碳水化合物稳态、蜕皮后组织重建以及生殖发育等作用。分析发现,Lv ILP1在凡纳滨对虾早期发育阶段有较高表达,在成体各个组织中均有表达,但在眼柄中表达量最高。本研究结果为深入了解凡纳滨对虾ILP的基因结构、进化、功能及表达提供了重要信息,同时为凡纳滨对虾的分子育种和健康养殖提供线索。

家蚕类胰岛素相关肽结合蛋白2(BmIBP2)的原核表达与组织特异性分析

【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员—类胰岛素相关肽结合蛋白2(BmIBP2),并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测,结果表明rBmIBP2具有良好的免疫反应性;用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的rBmIBP2,以纯化的rBmIBP2为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,Western blot结果显示家蚕的中肠组织匀浆液中有1条约28 kD大小的条带,大小与BmIBP2成熟肽的蛋白分子量基本一致,而脂肪体、血淋巴、丝腺、精巢及卵巢的组织匀浆液中没有检测到特异反应条带。【结论】成功地实现了BmIBP2在大肠杆菌中的表达和纯化,并获得其多克隆抗体,Western blot结果证明BmIBP2被正确表达,并明确了该蛋白只在家蚕中肠表达的组织特异性。

沉默类胰岛素多肽(Ilp)基因对褐飞虱翅和卵巢发育及海藻糖代谢的影响

【目的】类胰岛素多肽(insulin-like peptide,Ilp)位于胰岛素信号通路最上游,其在糖类物质调控中发挥关键作用。本研究则旨在探究Ilp在褐飞虱Nilaparvata lugens海藻糖代谢平衡的调控作用。【方法】以褐飞虱5龄若虫为实验材料,采用RNAi技术干扰Ilps的表达,观察RNAi后褐飞虱的表型以及雌成虫的卵巢发育。RNAi 48 h与72 h后,采用生化方法测定褐飞虱5龄若虫体内海藻糖、糖原和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性变化;采用qPCR检测海藻糖酶基因(TRE1-1,TRE1-2和TRE2)和海藻糖合成酶基因(TPS1和TPS2)的表达量变化。【结果】dsRNA可有效抑制Ilps的表达,导致褐飞虱出现异常翅型,且注射ds Ilp 3以及ds Ilp1+ds Ilp2+ds Ilp3+ds Ilp4发现褐飞虱2日龄雌成虫卵巢发育不完全。分别注射ds Ilp1-4和ds Ilp1+ds Ilp2+ds Ilp3+ds Ilp4后48 h均能显著提高葡萄糖含量;分别注射ds Ilp2,ds Ilp3及ds Ilp4后48 h显著提高了糖原含量;分别注射ds Ilp 3和ds Ilp 4后48 h能够显著提高海藻糖含量,而分别抑制Ilp2和Ilp472 h后海藻糖含量显著下降,但注射ds Ilp1+ds Ilp2+ds Ilp3+ds Ilp4后48和72 h海藻糖含量都显著上升。注射ds Ilp1+ds Ilp2+ds Ilp3+ds Ilp4后72 h可溶性海藻糖酶活性均显著上升,膜结合型海藻糖酶活性则在分别注射ds Ilp 3,ds Ilp 4和ds Ilp1+ds Ilp2+ds Ilp3+ds Ilp4后72 h显著下降;分别注射ds Ilp1,ds Ilp2和ds Ilp4后TRE1-1,TRE1-2,TRE2,TPS1和TPS2的表达量显著下降。【结论】沉默Ilp基因对褐飞虱的发育以及繁殖有一定的阻碍作用,且能够提高褐飞虱体内葡萄糖与糖原的含量,下调海藻糖酶与海藻糖合成酶基因表达量,提高可溶性海藻糖酶的活性,进而调控海藻糖的代谢。

家蚕素Ⅱ基因原核表达及蛋白纯化

【目的】建立一种简便、快速且能大量获得家蚕素Ⅱ(bombyxin-Ⅱ,BBXⅡ)的有效方法。【方法】运用RTPCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列,采用原核表达技术对该基因进行异源表达,并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA,并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ,经过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,使BBXⅡ获得了大量表达,进一步用HisTrap HP亲和层析,成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术,是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法,为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究,以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。