白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白的克隆、定位及表达分析

【目的】克隆受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因,分析其在感、抗病单株中的表达模式,探讨其在小麦抗白粉病过程中的作用机制。【方法】根据基因芯片结果,结合电子克隆与RT-PCR方法,克隆到一个受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因。通过中国春缺体-四体系对获得的基因片段进行定位。运用荧光定量PCR方法分析了该基因片段在抗病植株、感病植株白粉菌诱导的时空表达模式。【结果】获得了一个具有完整开放阅读框的小麦类萌发素蛋白基因片段,命名为TaGLP5(GenBank登录号为FJ594470)。系统进化分析表明该基因片段与已知的来自禾本科的萌发素蛋白分属不同的进化分支,很可能是新的小麦萌发素蛋白成员。通过中国春缺体-四体系将该基因片段定位在小麦的5A染色体上。定量PCR分析结果表明,该基因的表达受白粉菌诱导,且在接菌后的24h以前抗病中的表达量高于同期感病株。【结论】本实验获得的类萌发素蛋白是一个新的成员。该类萌发素蛋白在感、抗植物受白粉菌诱导上调表达,但是表达量、表达时间上存在差异。推测该基因参与了小麦对白粉菌的防御反应。

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。

植物类萌发素蛋白研究进展

在植物整个生长发育过程中时刻受到外界环境信号调控,遭遇各种逆境胁迫。在研究植物对逆境胁迫响应中,很多胁迫响应蛋白被发现。植物类萌发素蛋白(Germin-like proteins,GLPs)是其中一类重要的胁迫响应蛋白。它是一类与小麦萌发素(Germin)序列高度同源的、位于胞外基质的可溶性糖蛋白,几乎在所有生物中均发现有该类蛋白的存在。它具有多种生物学功能,在植物的生长发育阶段、生物和非生物逆境胁迫应答中起重要的作用。从植物GLPs的分类、结构等方面全面介绍了植物GLP蛋白的主要特点,同时归纳它在抵御生物胁迫及非生物胁迫等方面的研究进展,为今后的进一步研究提供参考。

亚麻类萌发素蛋白基因LuGLP1-13的克隆及表达分析

类萌发素蛋白(Germin-like proteins,GLPs)是一类防御应答蛋白,在植物抗病过程中发挥重要作用。前期研究工作发现一个类萌发素蛋白基因(Lus10003267)在亚麻盐碱胁迫下数字基因表达谱(DGE)数据中显著上调,推测该基因可能与亚麻盐碱应答胁迫有关。本研究利用亚麻Lus10003267基因序列和RT-PCR方法克隆了亚麻类萌发素蛋白基因,命名为LuGLP1-13,其CDS长687bp,编码228个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白质分子量为24.3ku,等电点为5.77,不稳定系数为23.64,是一种较稳定的酸性蛋白。该蛋白具有信号肽序列,是一种胞外分泌蛋白。多序列比对及进化分析表明,该蛋白具有典型的GLPs家族特征,与蓖麻、毛果杨及胡杨的GLPs家族蛋白亲缘关系相对最近。荧光定量PCR结果表明,亚麻Lu GLP1-13基因在盐碱胁迫下被显著诱导表达(尤其在碱性盐胁迫下),推测该基因可能参与亚麻应答盐碱胁迫的过程,这一结果为进一步研究亚麻LuGLP1-13基因的功能和耐盐碱分子机制提供了理论依据。

星星草类萌发素蛋白基因（PutGLP2）的克隆及生物信息学分析

类萌发素蛋白是一类种子萌发相关的特异性标记,其在植物生物和非生物胁迫应答过程中起到了重要作用。本研究通过酵母cDNA文库筛选,获得全长为1065bp的PutGLP2基因,其5′非翻译区164bp,开放读码框666bp,编码221个氨基酸,3′非翻译区235bp。利用PCR技术,克隆获得PutGLP2的ORF序列。生物信息学分析发现,PutGLP2在氨基端(N端)具有一个跨膜结构域及N端信号肽,预测定位于细胞壁或胞外间质。将PutGLP2与水稻的43种GLP蛋白进行聚类分析,发现PutGLP2属于类萌发素亚家族2成员之一,并与水稻OsGLP1-1相似性最高。本研究将为丰富植物类萌发素蛋白基因信息提供参考。

植物类萌发素蛋白研究进展

植物类萌发素蛋白是一类重要的胁迫响应蛋白,同时也是一类与萌发素基因序列高度同源、位于胞外基质的可溶性糖蛋白,几乎在所有的植物中都发现该类蛋白质的存在,在植物整个生长发育过程中发挥着重要的作用。本文综述了植物GLPs的结构特征及其在植物生长发育和生物以及非生物胁迫应答中的作用,以期为今后进一步研究植物类萌发素蛋白提供参考。

类萌发素蛋白在植物防卫反应中的作用

植物在生长过程中受到各种生物及非生物胁迫,在长期的适应过程中植物进化出多种抵御这些胁迫的策略,如病程相关蛋白(PRs)的激活等。类萌发素蛋白(GLPs)是PRs家族中的一类胞外糖蛋白,在植物中普遍存在。GLPs主要以酶、受体和结构蛋白的形式参与多种生理生化过程,能清除植物体内过多的活性氧(ROS),GLPs催化反应所产生的H2O2可通过选择性地参与信号级联途径来诱导植物的防卫反应,H2O2还可以通过纤维素交联作用增强细胞壁的结构,在植物抵抗氧化胁迫过程中起重要作用。本文综述了植物GLPs的结构特征及其参与的植物对逆境胁迫的防卫反应。

超表达岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2增强烟草对几种病原真菌的抗性

类萌发素蛋白(germin-like proteins,GLPs)是普遍存在于植物体内的具有多种功能的糖蛋白,属于cupins蛋白家族。岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2响应病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的入侵。为了验证该基因的功能,本文构建了LrGLP2的植物超表达载体并转入烟草中,PCR筛选获得了35棵阳性转基因烟草。Southern杂交和qRT-PCR分析显示,LrGLP2基因已成功整合到转基因烟草基因组中并稳定表达。体外抑菌实验表明LrGLP2转基因烟草叶片粗蛋白能够不同程度地抑制葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌丝的生长。活体接种结果显示,转基因烟草具有很强的抗尖孢镰刀菌和灰葡萄孢侵染的能力。此外,尖孢镰刀菌侵染前后,与野生型烟草相比,T_2代转基因烟草中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶和草酸氧化酶酶活性均显著增强。本文的研究结果表明岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2是一个抗真菌功能基因,在烟草中超表达增强了T_2代转基因烟草对几种病原真菌的抗性。

岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2的克隆及表达特性分析

类萌发素蛋白是植物中普遍存在的一类可溶性糖蛋白,在植物抗逆胁迫中起着重要作用。依据岷江百合编码GLP的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从岷江百合(Lilium regale Wilson)中克隆得到一个新的GLP基因的全长cDNA序列,命名为LrGLP2。LrGLP2全长cDNA为921 bp,含有654 bp的开放阅读框,49 bp 5非编码区以及218 bp 3 UTR,编码217个氨基酸的蛋白质。LrGLP2编码蛋白质与已知植物GLPs家族成员间的同源性和聚类分析表明LrGLP2与来源于水稻(Oryza sativa)、节节麦(Aegilops tauschii)、葡萄(Vitis vinifera)中的GLPs具有较高的相似性。qRT-PCR分析显示,LrGLP2在岷江百合正常生长发育的根中有一定量的表达,而在茎和叶中几乎检测不到表达量。水杨酸、茉莉酸以及H2O2处理均不同程度抑制LrGLP2的转录水平,但乙烯处理能明显诱导LrGLP2的表达。此外,岷江百合接种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)后,LrGLP2在接种后2 h表达迅速上调,12 h表达量急剧上升,至24 h表达量达到最大值,之后表达量下降,可见LrGLP2参与岷江百合对尖孢镰刀菌的防卫反应。

麦类作物萌发素及其相关蛋白研究进展

对萌发素的发现、作用、晶体结构、催化机理等方面的研究进行了回顾,并对其应用前景进行了展望.

天山雪莲SikGLP基因的克隆及表达分析

从天山雪莲cDNA文库中分析得到一个类萌发素蛋白基因序列,命名为SikGLP。生物信息学分析表明,该基因包含1个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6 kDa,理论等电点是6.81,并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高,具有的GLP的典型特征。17个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。Real time-PCR检测表明,SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达,可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。

BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

类萌发素蛋白(germin-like protein,GLP)是一类含有cupins结构域的糖蛋白,在植物基础抗性等方面起着重要作用。本研究人工合成了甜菜GLP基因BvGLP1,并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子RSS1P驱动的BvGLP1基因单子叶植物表达载体pA20-RSS1P::BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中,对转基因扬麦18的T0至T3代植株中BvGLP1进行了PCR、半定量RT-PCR和荧光定量QPCR检测,并对转基因小麦进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明,BvGLP1已转入转基因小麦扬麦18,并能在转基因小麦中遗传、转录表达;5个转BvGLP1基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦18有显著提高,说明BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性。

小麦和大麦GER4c基因启动子的分离及其锈菌诱导特性分析

病原菌诱导型启动子在植物-病原菌互作研究及基因工程育种中具有重要的利用价值,可根据抗病性的需求调控目的基因的表达。为挖掘小麦来源的锈菌诱导型启动子,为小麦抗条锈病的理论研究及育种应用提供基础,本研究分离了大麦类萌发素蛋白GER4c基因及其小麦同源基因的启动子,利用报告基因GFP表达载体在二穗短柄草中的异源表达,分析了启动子功能。发现小麦及大麦GER4c基因启动子表达模式相同,驱动报告基因在叶片中的表达量最高,在叶鞘、茎秆和小穗中显著降低。两个启动子均表现为锈菌诱导型启动子,转基因短柄草在接种锈菌小种F-Fl后,RT-PCR检测GFP在叶片中的表达量显著上调,显微镜下绿色荧光蛋白信号明显增强。研究结果为开展麦类作物抗条锈病相关研究提供了作物自身来源的诱导型启动子。

拟南芥GLP13基因在植物抗氧化胁迫响应中的作用

类萌发素蛋白(germin-like protein,GLPs)是一类与小麦萌发素序列相似性较高、位于胞外基质的可溶性糖蛋白,在植物的生长发育阶段以及对生物和非生物胁迫的应答中起着重要的作用。为了研究GLP13基因的生理功能,我们分离并鉴定了GLP13的敲减突变体glp13,同时构建了其超表达植株35S::GLP13。用甲基紫精(methyl viologen,MV)处理2种不同基因型和野生型(WT)植株,结果发现,与野生型相比,突变体glp13子叶变绿率较低,主根生长受抑制较明显;而超表达植株35S::GLP13子叶变绿率较高,主根生长的受抑制程度较WT轻。用MV处理2周的35S::GLP13植株,其叶绿素荧光参数Fv/Fm的下降较野生型对照缓慢。半定量RT-PCR分析结果表明,与野生型相比,经MV处理4小时后的35S::GLP13中抗氧化酶系基因FSD1的表达上调,而CAT1、CSD1和UGT71C1的表达水平在35S::GLP13、glp13和野生型植株三者之间没有明显差异。以上结果表明GLP13基因在拟南芥抗氧化胁迫响应中起重要作用。

过表达Mdip1基因提高番茄抗低温诱导的氧化胁迫能力

采用衣杆菌介导法获得了类萌发素蛋白（germin．1ikeprotein，Mdipl）超表达的转基因番茄植株，PCR和Southern杂交检测表明，外源基因分别以1～3个拷贝整合到番茄基因组中。Real．timePCR检测表明，在转基因个体中目的基因已经在受体基因组上完成整合，且不同株系间的表达有所差异。分析了低温下转Mdipl基因株系和野生型植株efAsA、GSH含量及H2O2累计的差异。与未转基因植株相比，Mdipl超表达植株在低温胁迫下根干重、冠干重和叶绿素含量显著高于对照，并显著提高了氧化还原信号AsA、GSH含量和AsA／DHA、GSH／GsSG以及GalLDH活性，降低了低温胁迫下叶片H2O2、MDA的积累，降低程度与表达量相关。亚细胞定位表明，H2O2的增加主要分布在质外体。表明MdipI基因通过调控氧化还原信号在番茄抗氧化胁迫响应中起重要作用。

香蕉GLP基因家族全基因组鉴定及表达分析

为揭示香蕉类萌发素蛋白(GLP)功能,对香蕉GLP基因家族(MaGLP)进行了全基因组鉴定,分析了基因结构、染色体分布和启动子顺式作用元件和转录因子结合位点(TFBS)分布情况以及编码蛋白的理化性质、保守基序、进化关系,同时基于转录组的结果研究它们在4℃和45℃处理的叶片、枯萎病菌FocTR4处理的根系以及自然成熟和乙烯催熟的不同成熟阶段的果实中的表达情况。结果显示:MaGLP家族共有44个成员,编码区CDS序列长度为567~2103 bp,分布于除10号染色体外的所有染色体上。大部分GLP基因包含1~2个外显子,多数GLP具有信号肽且主要定位在胞外。进化树分析发现,MaGLP可分为8个亚家族,其中亚家族M为香蕉特有。顺式作用元件和TFBS预测结果显示,MaGLP启动子区存在多种植物激素和逆境胁迫相关响应元件以及7种TFBS。MaGLP成员在香蕉不同组织部位中的表达水平差异较大且受多种胁迫调控。其中MaGLP5-1和MaGLP9-8对各种处理均有响应,MaGLP1-2和MaGLP9-4受高温、低温胁迫抑制,而Ma GLP9-6受高温、低温胁迫诱导,MaGLP5-4受高温和FocTR4调控,Ma GLP4-4仅响应高温胁迫。研究结果表明Ma GLP在香蕉抵御逆境过程中发挥重要作用。