类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景,重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,特别是在斑马鱼中的应用,为开展这一领域的研究工作提供参考。

类转录激活因子效应物核酸酶介导的E-cad和Bmi-1基因联合干预鼻咽癌的体外研究

目的:检测类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)介导的E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region-1,Bmi-1)基因联合干预对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。方法:构建多位点基因打靶载体p UC-DS1-E-cad-2ANeo-DS2(以下简称E-cad打靶载体)和p UC-DS1-Bmi-1 sh RNA-Zeo-DS2(以下简称Bmi-1打靶载体),将E-cad打靶载体、Bmi-1打靶载体及佛山科学技术学院分子医学研究院前期构建的TALEN载体以不同组合转染鼻咽癌CNE-2细胞。采用PCR检测靶基因的整合,Western印迹检测靶基因蛋白表达水平变化,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力变化。结果:靶基因E-cad和Bmi-1 sh RNA表达元件成功整合到鼻咽癌CNE-2细胞的基因组中;转染后鼻咽癌CNE-2细胞中E-cad的蛋白表达水平明显上升,Bmi-1的蛋白表达水平明显下降;干预E-cad及Bmi-1不影响细胞的增殖、周期和凋亡,但显著抑制细胞的迁移和侵袭能力,且E-cad和Bmi-1联合干预比单独干预更能显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞体外迁移能力(均P<0.01)。结论:TALEN介导的E-cad和Bmi-1联合干预能有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移和侵袭,可为人类癌症的基因治疗建立前期的实验基础。

类转录激活因子效应物及其在生物技术领域的应用

综述了类转录激活因子效应物(TALEs)技术的研究进展及生物技术应用前景,重点介绍TALEs的结构特征、作用机理、广谱抗性基因的人工构建及利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator like effector nucleases,TALENs)进行基因组定点修饰的策略。

基于类转录激活因子效应物(TALEs)的基因组定点操控技术

基于类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors,TALEs)的基因组定点操控技术能够对基因组功能体系的反向遗传操作于基因及转录水平进行精确操控。TALEs是来源于植物病原菌—黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)的DNA结合蛋白,其结合域通常由包含34个氨基酸残基的重复模块串联而成。根据编码规则,可人为重新编排重复模块顺序使其能够识别新的DNA序列。该人工设计TALEs对基因组的定点操控(包括转录调控和基因组编辑)已在体外培养的人类细胞和多种模式生物中得到了成功应用,为模式生物基因功能研究,农作物性状改善及人类遗传性疾病治疗等开辟了新时代。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)的构建及其在基因组定点修饰中的应用

类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一种新发现的基因组定点修饰工具。TALENs由TALE蛋白及II型核酸内切酶Fok I组成,其中TALE由多个重复的氨基酸序列构成,对DNA序列的识别达到一个重复单元结合一个碱基的程度,它在结合Fok I内切酶后就形成了具有DNA定点修饰功能的TALENs。该文主要介绍TALENs的构建及其在基因组定点修饰中的应用。

类转录激活样因子效应物核酸酶技术的原理及应用

类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是近年兴起的一种基因定点编辑技术,由特异性DNA结合结构域TALE和DNA切割结构域Fok I核酸内切酶组成。由于TALEN能对基因组中特异性基因进行识别和定点剪切,导致基因DNA双链断裂,进一步诱导DNA损伤后修复,可对基因组中的特定位点进行高效遗传操作,如基因的敲入、敲除和修复等。TALEN技术以其设计简单、特异性高、毒性低及靶点选择灵活等特点成为目前应用最为广泛的基因定点编辑技术。本文将就TALEN的原理、研究进展以及临床应用展望作一综述。

人工核酸酶用于基因组定点编辑的研究进展

人工核酸酶(EN)技术,是利用设计并构建的核酸内切酶与靶DNA序列特异性结合,形成双链断裂(DSB),启动DNA修复通路,进行基因组定点编辑,目前已成功应用于多种细胞和生物体。

人工转录激活子样效应因子核酸酶与多位点基因打靶载体的构建与鉴定

目的构建并验证针对人类基因组核糖体DNA（rDNA）序列的转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）表达载体与人类通用多位点基因打靶载体。方法运用在线软件TALENs Targeter在rDNA序列上设计TALEN切割位点，并构建针对该位点的TALEN表达载体，利用细胞转染技术，筛选出一对有较高活性的TALEN，并计算其切割效率。将TALEN切割位点两侧的同源重组引导序列DSl、DS2以及GFP表达元件克隆到pUC-19质粒中，最终将TALEN与多位点基因打靶载体共转染293T细胞，经PCR与测序鉴定，对目的基因整合情况进行验证。结果经酶切、测序鉴定，成功获得一对切割活性高达78．5％的TALEN（TALEN-L1R2），成功构建人类细胞通用的多位点基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2；两种技术结合后将目的基因GFP成功整合于293T细胞基因组中。结论TALEN与多位点打靶技术结合，可有效将目的基因整合于基因组中。

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型:锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.

TAL效应子应用研究进展

转录激活因子样效应子(transcription activator-like effectors,TALEs)是一类在植物病原黄单胞菌(plant pathogen Xanthomonas sp.)中发现的天然的DNA结合蛋白,它具有与目标DNA序列特异性结合的能力。随着研究的深入,TALEs的结构信息和特异性结合DNA序列的分子机理被破解,这就为人工设计构建TALE-DNA结构结合域提供了理论基础。人工构建的TALEs可以应用于各种各样的基因组工程,包括转录调控和基因组编辑。综述TALE的结构、TALE与DNA结合的分子密码,重点综述人工构建TALEs的应用,并对其未来的发展方向进行展望。

转录激活因子样效应物核酸酶

人工设计的核酸酶是目前进行精确基因组修饰的有效工具之一,在生命科学基础研究和人类遗传疾病的治疗研究领域有着广泛的应用价值。有必要综述转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)的技术背景,以及其应用研究基础上的核酸酶活性和特异性,并探讨TALEN用于靶向基因组修饰过程中所存在的一些问题。

人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析

目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78) bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区。采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子。结果通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体。荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP_1hCREG_586转录活性最高(P<0.05),pEGFP1_hCREG_358转录活性最低(P<0.05),pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_478转录活性差异均无统计学意义(P>0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5’上游序列–508/–281 bp区域。生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1。结论成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子。

2014-25中科院广州生物医药与健康研究院将转录激活因子样效应物核酸酶

（TALENs）技术应用于兔基因敲除研究，建立了兔基因打靶的高效平台。并利用这一技术平台，负责T细胞和B细胞重排的重组激活基因（RAG）敲除，建立了世界上首例免疫缺陷家兔疾病模型，相关成果在线发表于《细胞研究》上。

黄单胞菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白的研究进展

黄单胞菌借助保守的III型分泌系统,将多个效应蛋白注入植物细胞,克服宿主的防卫,利于黄单胞菌在植物体内发挥毒性功能。最近对III型效应蛋白致病机理开展了大量研究,结果发现具有酶功能的效应蛋白在黄单胞菌及其宿主间的相互作用中发挥非常重要的作用。此外,黄单胞菌存在一类独特的III型效应蛋白(Avr Bs3家族)。迄今为止,仅在黄单胞菌和雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中发现Avr Bs3家族效应蛋白,Avr Bs3家族通过模拟转录激活子来操纵寄主植物易感基因的表达。

基因组编辑技术为彻底清除体内人类免疫缺陷病毒带来曙光

迄今为止,获得性免疫缺陷综合征(AIDS)在全球仍是非常严重的传染病,没有彻底治愈的疗法。抗病毒疗法可抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)复制,但不能彻底清除潜藏在人基因组中的HIV基因组序列。最近,基因组编辑技术如锌指核酸酶(ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)技术被发现可成功破坏整合在人基因组中的HIV基因组序列,并成功诱导HIV辅助受体C-C趋化因子受体5(CCR5)缺失突变,而这种突变可抵抗HIV进入细胞。基因组编辑技术的成功应用将为治愈AIDS带来曙光。

基因编辑技术在免疫缺陷动物模型研究中的应用进展

免疫缺陷动物模型在临床前研究中发挥重要作用,是现代生物医学研究领域的重要实验工具,广泛应用于免疫学、遗传学、肿瘤学与微生物学等研究领域。基因编辑是针对生物体基因组进行靶向修饰的技术,从出现到应用,极大推动了生物医学研究领域的发展。基因编辑技术主要包括HEs、ZFNs、TALENs与CRISPR/Cas9系统。目前,研究者已利用该技术建立了多种类型的免疫缺陷动物模型,各有其优势和局限性。近年来,大量研究证实人源化免疫缺陷动物模型能够精准模拟癌细胞、药物以及免疫系统在人体内的作用,可以更好地模拟人类疾病,广泛用于研究人类免疫生物学及人类复杂疾病的潜在机制。本文对利用基因编辑技术构建免疫缺陷动物模型的研究应用进展进行综述,对基因编辑技术在免疫缺陷动物模型制备中存在的问题及优化策略深入探讨,并对其未来发展前景进行了展望,以期为研究者选用和建立免疫缺陷动物模型提供参考。

基因组编辑开启家蚕研究新纪元

蚕桑丝绸产业的主体产品是蚕丝,蚕丝性能改良的技术创新之于蚕桑丝绸产业的重要性和迫切性,尤其体现在蚕丝遗传改良相关的生物技术上。近年来,锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活效应子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列系统(CRISPR/Cas9)等基因组编辑技术的产生与发展,已经在生命科学基础理论研究、经济物种的遗传改造以及人类疾病的预防与治疗等领域掀起了一场如火如荼的革命。在家蚕基因组生物学国家重点实验室的研究团队和中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、日本国立农业生物资源研究所等国内外同仁的努力下,家蚕的研究也紧跟时代潮流,建立了基因组编辑技术体系,并跻身于众多模式生物基因组编辑技术的前沿阵列。更为可喜的是,部分家蚕基因组编辑的论文发表以后,得到了生命科学界、蚕桑丝绸业界和政府相关部门对蚕业科技的极大关注,其中有多篇SCI论文被高频次引用,蚕桑丝绸业界长期关注和难以解决的蚕丝遗传改良、丝腺生物反应器等问题在基因组编辑技术的介入后有望得到快速突破。本文就家蚕基因组编辑技术带给传统蚕桑丝绸产业的机遇,以及该项技术的发展、应用现状和前景作简要总结,以供研究者借鉴和参考。

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

基因编辑技术及其应用的研究进展

基因编辑技术是一项对生物体内源基因进行精准定点修饰的技术,极大地推动了生命科学的发展进程,是目前生物科学研究领域应用最广泛的技术。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和规律性重复短回文序列簇(CRISPR/Cas)。基因编辑技术可以特异性识别靶向序列,定点修饰靶向基因,进而深入研究目标基因的功能。基因编辑技术具有操作简便、作用效率高和脱靶率低等优势,因此广泛应用于生命科学研究、疾病模型的构建、药物研发以及农业生产等领域。作者主要介绍了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas 3种新型基因编辑技术,综述了基因编辑技术在基因治疗、品种研发和改良、研究功能基因以及构建疾病动物模型等方面的应用,简要讨论了基因编辑技术与传统转基因技术之间的区别,并对基因编辑技术的应用前景进行了展望。