褐飞虱体内类酵母共生菌与氨基酸营养的关系

利用全纯人工饲料饲喂技术,研究了缺失不同氨基酸对高温(35℃)处理后的缺菌褐飞虱NilaparvatalugensStal相对生长速度、体内共生菌数量的影响,发现10种必需氨基酸对缺菌褐飞虱生长的影响明显大于10种非必需氨基酸,饲料中必需氨基酸的缺少对褐飞虱(特别是高温处理褐飞虱)体内共生菌数量有一定的刺激作用。分析了缺菌试虫体内氨基酸组成和转氨酶活性的变化规律,发现在摄取的氨基酸营养相同的条件下(用全纯饲料D-97饲养),高温处理试虫体内蛋白质氨基酸组成无明显变化,而游离氨基酸总量明显上升,且必需氨基酸所占比例显著下降,其中组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)和苯丙氨酸(Phe)摩尔百分含量均显著下降,表明必需氨基酸的相对缺乏可能是体内蛋白质合成受阻的一个重要原因,推测这可能是由于试虫体内共生菌数减少致使所合成的必需氨基酸减少而引起。处理试虫体内谷氨酰胺合成酶(GS)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性明显提高,天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性显著降低,结合游离氨基酸中谷氨酰胺(Gln)显著增多,推测类酵母共生菌可能利用谷氨酰胺等为原料进行必需氨基酸的合成。

常用杀虫剂和杀菌剂对褐飞虱类酵母共生菌生长的影响

本文研究了常用杀虫剂和杀菌剂对褐飞虱类酵母共生菌生长的影响。结果表明,10%吡虫啉可湿性粉剂、48%毒死蜱乳油、10%溴氰菊酯乳油、25%噻嗪酮可湿性粉剂、1.2%印楝素乳油、75%百菌清可湿性粉剂、20%三环唑可湿性粉剂的5001、000、2 000倍液处理后共生菌的生长(菌落数量)显著减少,共生菌的假菌丝生长不舒展,有所萎缩,酵母多形成空泡。浓度越高、共生菌生长受到抑制越显著。低浓度(常规推荐剂量及以下)井冈霉素对共生菌生长影响较小,而高浓度(2倍常规推荐剂量)处理影响很大。这说明常用杀虫剂和杀菌剂农药对褐飞虱类酵母共生菌的生长均有较大的抑制作用。

水稻与褐飞虱互作过程中虫体内类酵母共生菌的个体大小及数量变化

褐飞虱腹部脂肪体内普遍存在类酵母共生菌，该类共生菌在虫体的生理代谢和营养利用等方面意义重大。研究采用冷冻切片技术结合显微摄像系统观察法测定了褐飞虱与水稻互作过程中虫体内共生菌的个体大小；并通过“血球记数法”测定了虫体内该类共生菌的含量。与取食感虫品种水稻TNI的褐飞虱相比，取食抗性水稻品种IR26（Bph1）和IR36（bph2）的褐飞虱体内共生菌的长度分别降低23．2％。24．4％和18．0％-32．7％，宽度分别降低24．4％-28．8％和8．6％-30．6％。取食抗性水稻品种的褐飞虱体内共生菌数量都显著下降。其中，连续取食IR26二代后褐飞虱体内共生菌显著降低，第三代后虫体内共生菌数量又有所回升。说明抗性水稻品种与褐飞虱互作会导致虫体内类酵母共生菌的发育变小、数量减少。

稻飞虱体内的类酵母共生菌及其营养功能

类酵母共生菌(yeastlikesymbiotes,YLS)是稻飞虱体内的一种共生菌,存在于稻飞虱的脂肪体细胞中,出芽生殖,通过卵直接传给后代,其数量随飞虱的生长发育而增加,但对于单位鲜虫重而言,基本保持恒定;系统进化研究结果显示,YLS在分类上属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲(Pyrenomycetes),其基因组大小与自由生活的酵母菌类似;共生体系中YLS可能为宿主提供必需氨基酸、蛋白质和固醇类等营养物质。现代分子生物学技术的发展为深入研究稻飞虱和类酵母共生菌的相互关系提供了有利条件,可以从基因水平证明二者的相互依赖性。

高温对灰飞虱体内类酵母共生菌和耐药性的影响

利用35℃高温分别处理灰飞虱田间种群和敏感品系初孵若虫1～3d，然后移至25℃下饲养至3龄。经1、2和3d处理后，灰飞虱体内类酵母共生菌数量分别减少了23．47％～34．23％、57．86％～61．51％和88．96％～90．71％；而类酵母共生菌的个体大小并无显著变化。进一步测定这些灰飞虱种群对杀虫剂吡虫啉、毒死蜱和锐劲特的耐药性，结果表明，高温处理时间越长，灰飞虱对这3种农药的耐药性越弱，即耐药性顺序为1d〉2d〉3d。

不同褐飞虱寄主种群类酵母共生菌形态和数量的比较

对分别在不同水稻品种TN1(感虫品种)、Mudgo(含Bph1抗虫基因)、ASD7(含bph2抗虫基因)上连续饲养了117代以上的3个褐飞虱寄主种群(分别称为TN1种群、Mudgo种群、ASD7种群)体内类酵母共生菌的形态和数量进行了比较。各褐飞虱种群类酵母共生菌的长和宽差异显著,且ASD7种群>TN1种群>Mudgo种群;长宽比无明显差异。种群间类酵母共生菌数量的差异因试虫性别而异,不同种群的褐飞虱雌虫含菌量无明显差异,雄虫则表现出TN1种群>ASD7种群>Mudgo种群的趋势,其中TN1种群与后两者差异显著,后两者间无显著差异。各褐飞虱种群转移到不同水稻品种上饲养1代,雌虫含菌量变化大多不明显,但雄虫较明显。感虫品种TN1上雄虫转移到两个抗性品种Mudgo和ASD7上饲养含菌量显著降低,抗虫品种上的雄虫转移到TN1上则含菌量显著增加,抗虫品种间的转移含菌量则没有明显变化。

褐飞虱类酵母共生菌菌体蛋白质提取方法的比较

为了筛选出适合褐飞虱Nilaparvata lugens类酵母共生菌蛋白质提取的细胞破碎方法,选择超声波破碎法、反复冻融法和液氮研磨法等3种细胞破碎方法提取共生菌吡虫啉敏感菌株和抗性菌株蛋白质。结果表明:菌体显微形态观察发现,使用超声波破碎法和液氮研磨法处理类酵母共生菌的细胞破碎效果均优于反复冻融法,处理后菌体分布均匀,破碎彻底;72 h是提取菌体蛋白质的最佳培养时间。定量分析表明:用超声波破碎法提取蛋白质质量浓度最高,液氮研磨法次之,反复冻融法提取蛋白质质量浓度的效果最差,各方法所提蛋白质质量浓度差异显著(P<0.05)。培养72 h后,超声波破碎法、液氮研磨法和反复冻融法提取的蛋白质质量浓度分别为2.82 g·L-1,2.62g·L-1和2.12 g·L-1(敏感菌株)及2.64 g·L-1,2.53 g·L-1和2.05 g·L-1(抗性菌株)。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析发现:超声波破碎法获得的蛋白质不仅得率高,且条带清晰,丰度好。液氮研磨法虽得率高,但蛋白质部分降解,条带不清晰;而反复冻融法获得的蛋白质得率最低。超声波破碎法更适合于褐飞虱类酵母共生菌的蛋白质提取,该研究为后续蛋白质的双向电泳实验和分离差异蛋白质提供技术支撑。

类酵母共生菌中两个组氨酸合成基因在褐飞虱发育中的作用

褐飞虱[Nilaparvata lugens（Stl）]是我国水稻上的主要害虫,专一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻筛管液。利用基因组和转录组数据,人们构建了褐飞虱及其体内类酵母共生菌（YLS）参与组氨酸等必需氨基酸的合成途径。在此基础上,本研究旨在通过基因克隆和RNA干扰研究YLS的His2和His6（分别命名为EdeHis2和EdeHis6）在褐飞虱生长、发育和存活中的作用。同源搜索和系统发育分析表明EdeHis2和EdeHis6均源于YLS基因组,与绿僵菌His2和His6高度同源并在系统发育树中形成一个簇,但在褐飞虱基因组中无同源基因。基因的时空表达分析表明,His2和His6在褐飞虱的各个龄期均表达且呈现一定的波动性,在褐飞虱脂肪体中的表达量均显著高于头、足、体壁和中肠。此外,在褐飞虱头和翅的基因组中未能扩增到目的片段,而在腹部能扩增出目的片段。分别注射外源双链RNA（dsEdeHis2或dsEdeHis6）后的第2、4、6天,EdeHis2的表达量分别显著下调45%~60%,EdeHis6下调27%~55%。dsEdeHis2和dsEdeHis6分别使褐飞虱的死亡率提高了8.3%和9.2%,雌、雄虫的若虫期历期延长了0.43d、0.33d和0.65d、0.36d,但均未达到显著水平。另外,注射dsEdeHis6的褐飞虱雌雄成虫翅畸形率分别为11%和13%,显著高于对照组。综上所述,源于YLS的EdeHis2和EdeHis6参与褐飞虱组氨酸的合成,与褐飞虱的存活、发育和翅发育相关。

三种稻飞虱体内类酵母共生菌18S rDNA和ITS-5.8S rDNA序列克隆及进化分析

为研究水稻3种主要害虫灰飞虱Laodelphax striatellus、褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera体内类酵母共生菌(yeast-like symbiotes,YLS)的种属地位及与寄主的进化关系,测定了其体内YLS的18S rDNA及ITS-5.8Sr DNA的全长序列。基于3种稻飞虱体内YLS的18SrDNA序列比对表明,褐飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与灰飞虱YLS的高(褐飞虱YLS和白背飞虱YLS为98.91%,灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为95.74%,灰飞虱YLS和白背飞虱YLS为96.02%),而基于ITS-5.8SrDNA序列比对,灰飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与褐飞虱YLS的要高(白背飞虱YLS和灰飞虱YLS为99.57%,灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为91.91%,白背飞虱YLS和褐飞虱YLS为90.46%)。基于真菌18SrDNA和ITS-5.8SrDNA的系统发育树均表明,3种稻飞虱体内YLS与其他已知真菌进化关系较远。本研究证实了昆虫真菌类共生菌与寄主形成了长期的进化关系,从而形成了不同于已知真菌的分类地位。

灰飞虱体内一种酵母类共生菌的分子鉴定

为明确稻飞虱体内酵母类共生菌(yeast-like symbiont,YLS)的种类,采用超速离心的方法分离纯化灰飞虱Laodelphax striatellus(Falln)体内YLS,用真菌的通用引物对其18SrDNA、5.8S-ITSrDNA全长序列进行扩增。结果得到一条分子量约为2340bp的序列。序列同源性分析表明,该菌与Noda等所报道的类酵母菌的18SrDNA序列差异较大(同源性只有89.6%),而与季也蒙毕赤酵母Pichia guilliermondii有99.8%的同源性。原位杂交(ISH)和巢氏PCR均证明该菌存在于灰飞虱脂肪体和卵内,但数量较少。因此,灰飞虱体内YLS除了Noda等报道的类酵母菌外,尚存在另外一种季也蒙毕赤酵母菌。

类酵母共生菌与灰飞虱卵巢发育和产卵量的关系

为明确灰飞虱体内类酵母共生菌(YLS)在生殖发育中的作用,采用血球计数法并结合显微摄像系统,研究了灰飞虱雌虫体内YLS的数量动态及与卵巢发育和产卵量之间的相互关系。结果显示,25℃常温和35℃高温处理的灰飞虱体内YLS数量均随成虫的生长而下降,高温处理4龄若虫可以显著减少成虫体内YLS数量。25℃和35℃处理,灰飞虱卵巢发育级别和其体内YLS数量均存在显著负相关(r=-0.903,P<0.05;r=-0.970,P<0.01),而日均产卵量则与其YLS数量呈显著正相关(r=0.725,P<0.05;r=0.659,P<0.05)。表明共生菌的存在有利于灰飞虱的卵巢发育与卵子成熟。

灰飞虱类酵母型共生菌18SrDNA序列变异及系统发生

分离纯化了云南楚雄、宁夏银川、北京通县、上海七宝镇、四川西昌５个地区的灰飞虱体内类酵母型共生菌（Ｙｅａｓｔ－ｌｉｋｅ Ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ， ＹＬＳ），并对其１８Ｓ ｒＤＮＡ的约６００ｂｐ的序列进行了测定。结合已有的序列，构建了不同宿主的ＹＬＳ的分子系统树。结果表明，灰飞虱的ＹＬＳ属于子囊菌亚门Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ纲，与此纲的Ｈ ｃｈｒｙｓｏｏｐｅｒｍｕｓ亲缘关系最近。我国各地区及日本的灰飞虱体内ＹＬＳ可能是同一种的不同地理群体，不同的ＹＬＳ在其宿主分化后才选择了不同的宿主，之后与其宿主长期共同进化、共同适应。

褐飞虱体内酵母类共生菌的形态观察

试验采用冷冻切片技术结合显微摄像系统观察研究了褐飞虱雌成虫体内酵母类共生菌的形态特性和在寄主虫体内的存在状态。光学显微镜观察证实,褐飞虱雌成虫的头部和胸部均未观察到共生菌,在其腹部脂肪体中却发现大量酵母类共生菌的存在,且有大量的菌胞出现。菌胞已经成为褐飞虱特有的细胞器,其发育可划分为发育初期、共生菌增殖适应期、对数增殖期(高峰期)、释放期和衰竭期5个阶段。按照形态划分,褐飞虱体内的酵母类共生菌有4大类型,即长梭形、杆状、卵形和球状。其中,长梭形和杆状个体最多、占绝大多数,卵形和球状个体很少见。此外,还发现具假膈梭形和不规则共生菌的存在。同时观察到该类共生菌通过多边芽殖进行无性繁殖,且以顶端芽殖(包括两端芽殖)为主。

三种稻飞虱成虫体内酵母类共生菌的形态差异

试验采用冷冻切片技术结合显微摄像系统观察法研究了酵母类共生菌在3种稻飞虱成虫体内的存在状态、形态特性以及种类和组成。光学显微镜观察证实,3种稻飞虱成虫的头部和胸部均未观察到共生菌,在其腹部脂肪体中有大量酵母类共生菌,且以出芽进行无性繁殖,并伴有菌胞的出现。3种稻飞虱成虫体内共生菌的形态和组成明显不同。其中,褐飞虱体内的共生菌个体较大,以梭形、杆状和卵形为主,分别占共生菌总数的30·7%、53·5%和15·1%;灰飞虱和白背飞虱体内的共生菌个体较小,以卵形为主,分别占共生菌总数的93·4%和94·7%。此外,褐飞虱成虫体内的各类共生菌都显著大于灰飞虱和白背飞虱成虫体内的同种类型个体,且灰飞虱和白背飞虱体内的同种共生菌个体大小之间也存在一定差异。

一株褐飞虱内共生菌的分离及分子鉴定

运用卵块离体培养法,从褐飞虱(Nilaparvata lugens St■l)卵块中分离筛选到1株类酵母菌菌株,命名为34号菌株。比较34号菌株与直接从褐飞虱虫体内分离的类酵母共生菌(yeast-like-symbiotes,YLS)26S rDNA序列同源性,并将结果在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,结果显示两种菌株都与子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyreno-mycetes)的解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)显示出较近的亲缘关系,初步表明分离所得34号菌株可能为褐飞虱内共生菌的一种,同时也说明褐飞虱体内共生菌可通过离体培养的方式获得。

褐飞虱不同致害性种群体内共生菌18SrDNA部分序列比较

分离纯化了褐飞虱3种不同致害性种群体内类酵母共生菌(yeast-likesymbionts,YLS),并对其18SrDNA基因序列进行了比较。结果表明,褐飞虱3种不同致害性种群体内类酵母共生菌18SrDNA均扩增出600bp左右的片断。依据获得的18SrDNA特异性序列,结合已知真菌的18SrDNA部分序列,构建了不同宿主的YLS分子系统树。结果显示,褐飞虱3种不同致害性种群体内的YLS同属子囊菌亚门(Ascomycotina)的核菌纲(Pyrenomycetes),并与此纲中的Hypomyceschrysospermus亲缘关系相对最近。

食料对烟草甲共生菌数量和生长发育的影响

烟草甲Lasioderma serricorne(Fabricius)消化道内含有一种类酵母共生菌,其在烟草甲的营养需求和对外源物质的解毒过程中有重要作用。以麦粒、烟叶、麦片、甘草和面粉为食料饲养烟草甲,研究了食料对烟草甲共生菌数量和发育历期的影响,发现:烟草甲5龄幼虫体内的共生菌数量最多,蛹次之;食料对共生菌的数量有显著的影响,尤其在5龄幼虫期;麦粒饲养的烟草甲发育历期最短、体内的共生菌数量最多,而甘草饲养的烟草甲发育历期最长、体内的共生菌数量最少;共生菌的数量与烟草甲的生长发育历期之间存在着明显的负相关关系。

烟草甲体内共生菌的初步研究

烟草甲Lasioderma serricorne(Fabricius)体内有类似酵母的胞内共生物YLS,其对烟草甲有重要的营养和解毒作用.该文对YLS的细胞和菌落形态进行了观察,并通过菌落测定、液体培养和细胞质量测定等方法,以探明YLS的最适生长温度.结果表明:28～35℃比较适宜YLS的生长,35℃为最佳生长温度,而36～48 h是研究YLS的最佳时间.

芽孢杆菌的引入对褐飞虱微生物群和生长发育的影响

【目的】明确褐飞虱Nilaparvata lugens体内可培养共生细菌的种类,探索其中芽孢杆菌类共生菌对褐飞虱微生物群和生长发育的影响。【方法】通过离体培养的方法,从褐飞虱两种不同致害性种群(TN1敏感种群和IR56高致害种群)中分离可培养共生细菌。通过16S rDNA测序对获得的可培养共生菌进行鉴定,在此基础上利用原位杂交研究了共生细菌在褐飞虱体内的分布。利用人工饲料添加抗生素和回补共生细菌的方式,研究了减菌和回补芽孢杆菌的处理对褐飞虱生长发育以及共生菌丰度的影响。比较了通过饲喂和显微注射对芽孢杆菌引入的影响,考察了芽孢杆菌的定殖与褐飞虱TN1种群致害性之间的相关性。【结果】利用离体培养法从褐飞虱中获得了15株不同的共生细菌,其中包括2株源于IR56高致害种群的芽孢杆菌类共生细菌BPH-S36和BPH-S33。原位杂交结果表明共生细菌在褐飞虱成虫唾液腺、肠道、脂肪体和雌虫内生殖器中均有分布,而在雄虫内生殖器中鲜有分布。体内共生细菌对褐飞虱的生长发育至关重要,共生细菌的减少导致褐飞虱存活率在第3和6天时显著下降,而回补共生芽孢杆菌BPH-S36或BPH-S33可使其存活率在第6天时显著上升。褐飞虱通过取食添加共生芽孢杆菌的人工饲料可使芽孢杆菌的相对丰度增加23.2~24.5倍,而通过若虫显微注射并不能够提高芽孢杆菌的相对丰度。随着共生芽孢杆菌的增加,类酵母共生菌(yeast-like symbiont,YLS)的相对丰度也显著增加5~12倍。芽孢杆菌BPH-S36的引入使褐飞虱敏感种群TN1在抗性水稻IR56上的存活率由52.1%±1.5%显著提高至64.2%±3.0%。【结论】共生细菌在褐飞虱唾液腺、肠道和卵巢中广泛分布。抗生素处理能够有效降低其体内共生细菌的丰度,从而导致存活率下降。人工饲喂法可以使外源共生细菌在褐飞虱体内成功定殖。源于致害性强的褐飞虱种群中的芽孢杆菌BPH-S36可提高该种群对抗性水稻品种IR56的致害性。

杀菌剂与吡虫啉混合配剂对褐飞虱种群增长的影响

褐飞虱Nilaparvata lugens St?l是亚洲国家水稻产区的主要害虫,其腹部脂肪体内存在大量类酵母共生菌(Yeast-like symbiotes,YLS)。YLS对褐飞虱的生长发育和繁殖起着至关重要的作用。以YLS为靶标,通过抑制褐飞虱体内YLS从而控制褐飞虱的发生必将是今后有效防治褐飞虱的新途径。前期研究表明,与单一的化学杀虫剂相比,杀虫剂和杀菌剂的混配制剂因能有效抑制褐飞虱体内YLS的数量从而导致褐飞虱更高的死亡率。本研究利用生命表和Morris-Watt数学模型分析了27%丰加霉素&四霉素P&四烯菌素B&四霉素A和75%肟菌酯&戊唑醇分别与吡虫啉的混合配剂对褐飞虱种群增长影响。结果表明,2种混合配剂处理后褐飞虱体内YLS的数量均明显下降,且褐飞虱种群增长指数显著低于吡虫啉处理组,混合配剂对褐飞虱的抑制作用主要表现在卵孵化期和成虫产卵期。本研究结果为褐飞虱防治提供了新的思路和方法。