下调RNA解螺旋酶DDX5表达对胶质瘤SHG44细胞周期和凋亡的影响及其机制

目的探讨下调RNA解螺旋酶DDX5表达对胶质瘤SHG44细胞周期和凋亡的影响及其机制。方法2018年3月至2019年4月,将体外培养的SHG44细胞分为小干扰RNA(siRNA)-阴性对照(NC)组(转染NC siRNA)和siRNA-DDX5组(转染靶向DDX5的siRNA),采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组细胞中DDX5 mRNA的表达水平,流式细胞仪分别检测各组细胞周期分布和凋亡率,蛋白质印迹法检测细胞中DDX5、β-连环素、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和存活蛋白的表达水平。结果与siRNA-NC组比较,siRNA-DDX5组细胞中DDX5 mRNA[(0.25±0.02)比(0.98±0.06)]和DDX5[(0.23±0.03)比(0.68±0.05)]、β-连环素[(0.25±0.02)比(0.80±0.06)]、c-Myc[(0.37±0.03)比(0.85±0.06)]、cyclin D1[(0.30±0.02)比(0.89±0.06)]和存活蛋白[(0.42±0.03)比(0.83±0.06)]蛋白的表达水平均明显减弱,细胞在G0/G1期所占百分比明显降低[(56.15±2.28)%比(65.76±3.22)%],而在S期所占百分比[(37.26±2.03)%比(26.95±1.16)%]和细胞凋亡率[(18.95±2.23)%比(7.02±1.26)%]明显升高(P<0.05)。结论下调DDX5表达可诱导胶质瘤SHG44细胞周期阻滞于S期并促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-连环素信号通路的活化有关。

SARS冠状病毒多聚酶区抗原在感染诊断中的作用探讨

目的原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白RNA多聚酶表位区,了解其在SARS-CoV感染诊断及作为病毒复制指标方面的意义。方法通过PCR扩增获得RNA多聚酶表位区基因,与原核表达载体pET32a+连接,转化大肠杆菌BL-21表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后,应用ELISA检测SARS患者及动物模型血清标本的IgG抗体。结果获得原核表达的RNA多聚酶表位区。ELISA检测正常人血清均阴性,SARS患者血清阳性率为95%;检测SARS病毒感染实验动物血清阳性率100%,灭活纯化病毒接种恒河猴均为阴性。结论RNA多聚酶表位区具有很好的免疫原性,可用于感染诊断的检测及作为病毒复制的指标。

高三尖杉酯碱对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及机制研究

目的探讨高三尖杉酯碱(HHT)对人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法采用改良的K rupp荧光素标记的端粒重复扩增(TRAP)方法检测HHT对Jurkat细胞端粒酶活性的影响。半定量RT-PCR方法检测HHT作用后Jurkat细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)及c-m yc原癌基因mRNA的表达水平。结果HHT对Jurkat细胞端粒酶活性及hTERTmRNA、c-m yc基因mRNA表达有明显抑制作用。结论HHT可通过下调hTERT基因转录抑制淋巴细胞的端粒酶活性。c-m yc可能参与调控淋巴细胞hTERT基因转录。

真核生物Ⅱ类基因转录起始的调控

真核生物Ⅱ类基因的转录起始是一个极其复杂并受到严格调控的过程。有两种转录起始复合物：一种是包含 Ｔ Ｂ Ｐ， Ｔ ＦⅡ和ｐｏｌ Ⅱ的分步组装复合物；另一种是 Ｒ Ｎ Ａ 聚合酶Ⅱ全酶。两条调控途径：一是组蛋白对基因的封闭作用；二是顺式作用元件与反式作用因子的相互作用。目前有关蛋白质 Ｄ Ｎ Ａ 识别的立体化学规律、蛋白质因子 Ｔ ＦⅡ Ｄ（ Ⅱ类基因转录因子 Ｄ） 以及 Ｓｗｉ／ Ｓｎｆ 蛋白在转录起始中的作用的研究均已取得一定进展。当前对转录激活机制的一种新观点为三分体模式。

RNA催化剂研究进展

RNA催化剂(Ribozyme)最初由美国的切克(Thomas Cech)和加拿大的阿尔特曼(Sid-ney Altman)各自独立地发现并命名,意指具有催化能力的 RNA。从而改变了生物催化剂的传统概念。为此,他们共同获得了1989年诺贝尔化学奖。从此之后的几年内。

DEAD⁃box解螺旋酶46基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的分析短发夹RNA(shRNA)介导DEAD⁃box解螺旋酶46(DDX46)基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录PCR(RT⁃qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定人正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中DDX46表达差异。以慢病毒介导的shRNA敲低乳腺癌SK⁃BR⁃3细胞中DDX46的表达,实验分为空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组。RT⁃qPCR检测各组细胞DDX46 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测DDX46蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平,克隆形成和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果DDX46 mRNA在各乳腺癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞(P<0.05)。sh⁃DDX46组细胞DDX46 mRAN和蛋白表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。sh⁃DDX46组的细胞生长增殖能力明显低于两对照组(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率分别为(4.21±1.65)%、(5.36±1.23)%和(10.21±2.39)%,与空白对照组和阴性对照组相比,sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率明显增加(P=0.007;P=0.016)。沉默DDX46后凋亡通路蛋白B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)的表达量明显降低(P<0.05),Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶⁃3剪切体(cleaved Caspase⁃3)表达明显增高(P<0.05)。结论DDX46在乳腺癌细胞中高表达,沉默DDX46基因能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡,凋亡信号通路可能是其作用机制之一。

lncRNA MIR31HG对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及作用机制研究

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)MIR31HG对甲状腺乳头状癌(PTC)细胞增殖、迁移、侵袭的影响及可能的作用机制。方法选取2018年8月—2019年4月在湖南省中医药大学第一附属医院行甲状腺癌根治术的48例患者的新鲜癌组织及癌旁组织标本,男女各24例。利用TCGA数据库验证lncRNA MIR31HG在甲状腺癌组织与癌旁组织中的表达,患者术后病理报告确诊为PTC,提取样本RNA行qRT-PCR验证lncRNA MIR31HG在PTC组织与癌旁组织中表达情况及与患者临床病理特征的相关性;利用lncRNA MIR31HG的小干扰RNA转染PTC细胞系TPC-1并验证抑制率,保证抑制率>60%,MTT检测TPC-1细胞增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力,Western blotting检测Akt信号通路关键蛋白分子Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、PTEN的表达。结果宫颈鳞状细胞癌、乳头状肾细胞癌、头颈部鳞癌、胰腺癌及甲状腺癌组织lncRNA MIR31HG相对表达量较癌旁组织高(P<0.05),膀胱癌、前列腺癌组织较癌旁组织低(P<0.05)。PTC组织lncRNA MIR31HG相对表达量较癌旁组织高(P<0.05)。TPC-1、K1及BCPAP的lncRNA MIR31HG相对表达量较Nthy-ori 3-1高(P<0.05),且TPC-1相对表达量最高。实验组lncRNA MIR31HG相对表达量均较siRNA-NC组下降(P<0.05),其中siRNA-1组与siRNA-3组沉默效率均>60%。各组OD值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-1组与siRNA-3组划痕愈合率较siRNA-NC组低(P<0.05)。siRNA-1组、siRNA-3组侵袭至Transwell小室下室的细胞数较siRNA-NC组低(P<0.05)。siRNA-1组、siRNA-3组PTEN mRNA和蛋白较siRNA-NC组升高(P<0.05),且siRNA-3组最高;siRNA-1组、siRNA-3组p-Akt蛋白较siRNA-NC组低,且siRNA-3组最低(P<0.05)。结论lncRNA MIR31HG在PTC组织中高表达并与PTC患者肿瘤分期有关;下调lncRNA MIR31HG的表达可以抑制TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭能力,其机制可能与lncRNA MIR31HG抑制PTEN表达从而激活Akt通路有关。

槲皮素对人早幼粒白血病细胞体外核转录活性影响

分别用4，20，100μmol／L槲皮素处理培养的HL－60细胞2d，或用20μmol／L槲皮素处理0～4d.分离纯化细胞核进行体外核转录实验，测定总RNA聚合酶活性和RNA聚合酶Ⅱ活性。结果显示，格皮素处理HL－60细胞后，体外核转录活性降低，总RNA聚合酶活性尤其是RNA聚合酶Ⅱ活性受抑制，并呈时间和剂量依赖关系。推测树皮素抑制HL－60细胞RNA聚合酶活性，特别是抑制RNA聚合酶Ⅱ活性，可能是树皮素抑制HL－60细胞生长和增殖的作用机理之一。

应用RNA聚合酶Ⅰ反向遗传操作技术拯救汉滩病毒84FLi株微基因组

目的建立基于汉滩病毒（HTNV）84FLi株L片段的RNA聚合酶Ⅰ微基因组拯救体系。方法将含有氯霉素乙酰转移酶（CAT）编码区的cDNA插入含有HTNV 84FLi株L片段5′端和3″端非编码区的质粒内的两个非编码区之间，将此cDNA嵌合体（polⅠ表达盒）克隆人人polⅠ启动子和终止子之间，分别获得正义和反义方向的RNA polⅠ转录报告质粒。用报告质粒转染293T细胞或等量293T和HTNV感染的Vero混合培养细胞，在HTNV的L蛋白和核衣壳蛋白表达质粒共转染后48h收获细胞，检测CAT活性。用上清液感染293T细胞，了解CAT活性的传代能力。结果构建了正义和反义方向的HTNV 84FLi株L片段微基因组RNA聚合酶Ⅰ报告质粒pLvRNA-CAT和pLcRNA-CAT，用此质粒转染细胞后能检测到CAT的表达，且CAT活性能在拯救病毒微基因组中传代。结论应用RNA聚合酶Ⅰ反向遗传操作技术成功拯救了HTNV 84FLi株微基因组。

T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT

目的 T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(Cellular FACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达。方法以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时用酶联免疫方法检测hTERT及CEA作为比对。结果 64例结直肠癌患者血清hTERT阳性率是45.3%(29/64),血清CEA阳性率是57.8%(37/64);Cellular FACTT方法检测循环肿瘤细胞的hTERT检出率为81.3%(52/64)。其检测的灵敏度与酶联免疫检测方法有显著差异P<0.01。结论 T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较酶联免疫检测方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断。

探讨酶的化学本质

根据细胞为内酶的化学本质将酶分为蛋白酶和核酶,介绍几种核酶在RNA加工中的特异性作用,从而在高中生物学教学中将两种不同类别的酶作明确区分,增强学生对酶的化学本质的理解,使学生在遇到具体问题时能够具体分析、作答,提高答题的正确率.

散发性肌萎缩侧索硬化患者Senataxin基因的突变检测和分析

目的探讨散发性肌萎缩侧索硬化（SALS）患者Senataxin（SETX）基因突变特点。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增60例SALS患者SETX基因的26个外显子，应用直接基因测序法筛查其突变和多态，同时与200名健康对照进行比较。结果我们检出2个新的同义突变，分别为Asp844Asp（GAC→GAT）和Phe998Phe（TTC→TTT）。尽管在200名健康对照中未检出这2个同义突变，但经过不同物种间的同源序列比对，发现这2个序列不是保守序列，提示它们不是致病性突变。除此之外，我们还检出了19个多态。结论我们发现了SETX基因的2个同义突变和19个多态，进一步扩大了SETX基因的突变谱和多态谱。