利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种调控基因表达的方法,其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA(dsRNA)或siRNA,导入生物体内,使内源靶基因中同源mRNA降解,从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白(cadherin-likeprotein)是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质,是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段(CAD1和CAD2),合成相对应的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA);并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内,测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明:将70nLCAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48h后,基因表达量显著下降,72h后恢复。免疫印迹检测结果表明,类钙粘蛋白在注射dsRNA48h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默,该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。

昆虫Bt作物抗性与中肠类钙粘蛋白的关系

Bt作物已在世界范围内广泛种植,为有效控制害虫的危害发挥了重要作用。靶标害虫的抗性问题是影响Bt作物长期利用的关键因素。通过分析Bt Cry1A毒素的主要受体类钙粘蛋白(cadherin-like)的生物学特性及其与Bt毒素的结合作用,讨论类钙粘蛋白基因突变与Bt抗性的关系,综述了基于基因突变的抗性分子检测技术的研究进展。

昆虫类钙粘蛋白与BtCry1A蛋白之间的相互作用

类钙粘蛋白(cadherin-likeprotein)位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡(brushbordermembranevesicles,BBMV)上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)产生的杀虫晶体蛋白(BtCry蛋白)的主要受体之一。它能够与BtCry蛋白结合,引起细胞膜的渗透性发生改变,促进BtCry蛋白对敏感昆虫的毒杀作用。类钙粘蛋白基因的突变还能导致敏感昆虫对BtCry蛋白产生抗性。因此,研究昆虫类钙粘蛋白与BtCry蛋白之间的相互作用,将有助于揭示BtCry蛋白杀虫作用机理。文章对昆虫类钙粘蛋白种类、结构特征、在昆虫体内的分布、及其与BtCry蛋白之间的相互作用等方面的研究现状进行详细论述。

苏云金芽孢杆菌Cry1A毒素抗性相关受体类钙粘蛋白的研究进展

综述了Cry1A毒素的受体类钙粘蛋白的结构 ,受体与毒素的结合特性 ,受体基因在离体细胞中的表达和表达产物介导Cry1A毒素裂解细胞的功能 ,以及受体基因的突变与抗性的关系 。

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。

家蚕类钙粘蛋白BtR-175基因敲除突变体创制和抗性检测

家蚕类钙粘蛋白BtR-175不仅是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)晶体毒素蛋白的受体蛋白,也是黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombysepticus)晶体毒素蛋白的受体分子。为建立对黑胸败血芽孢杆菌具有抵抗能力的家蚕品系,采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术,设计引导RNA(gRNA)对家蚕BtR-175基因进行精确定点编辑,对蚕卵显微注射重组质粒pU C57-hA 4-Cas9和T-U6-BtR-175后,筛选获得2个碱基插入导致蛋白质翻译提前终止的BtR-175基因敲除突变体,命名为ΔBtR-175。4龄起蚕经口添食黑胸败血芽孢杆菌,结果ΔBtR-175突变体家蚕的死亡率为34.4%±5.8%,野生型家蚕的死亡率为57.8%±8.4%,表明ΔBtR-175对黑胸败血芽孢杆菌的侵染抵抗性显著提高。饲养试验显示ΔBtR-175突变体和野生型家蚕的茧层量没有显著性差异。该突变体有望进一步培育为家蚕抗性育种素材。

粘虫类钙粘蛋白基因的克隆、序列分析及时空表达

昆虫中肠膜类钙粘蛋白(cadherin-like protein,CLP)是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)毒素的重要受体之一,与Bt毒素的杀虫作用机制以及昆虫对Bt毒素的抗性等密切相关。本研究应用RT-PCR和RACE技术,克隆了迁飞性重要害虫粘虫Mythimna separata类钙粘蛋白基因全长cDNA序列(命名为Msclp,GenBank登录号为JF951432),全长5642bp,编码1757个氨基酸,推导的氨基酸序列具有昆虫类钙粘蛋白的特征结构,包括1个信号肽、1个前蛋白区、12个钙粘蛋白重复、1个近膜区、1个跨膜区和1个胞质区。预测的分子量和等电点分别为196.786kD和4.5。该蛋白与同科的烟夜蛾Helicoverpa assulta、烟芽夜蛾Heliothis virescens、棉铃虫Helicoverpaarmigera及甜菜夜蛾Spodoptera exigua的类钙粘蛋白亲缘关系最近,氨基酸序列一致性分别为61.77%,61.66%,61.26%和58.14%。荧光定量RT-PCR分析表明,该类钙粘蛋白基因在不同龄期的粘虫幼虫中表达量差异极显著(P<0.01),其中4龄幼虫相对表达量最高,但与3龄、6龄幼虫并没有显著性差异;1和2龄幼虫表达量最低;表达部位主要在粘虫中肠,在中肠以外的虫体其他部位表达量极低。这些结果对于揭示转Bt作物对非靶标、迁飞性粘虫的杀虫作用机制以及评价其潜在的对Bt毒素抗性机制等奠定了基础。

暗黑鳃金龟幼虫类钙粘蛋白基因的克隆及组织表达特异性分析

旨在为深入研究Bt毒蛋白的致毒机制和昆虫对Bt毒素的抗性机制提供依据,采用RT-PCR、RACE和qPCR技术克隆并分析暗黑鳃金龟幼虫类钙粘蛋白基因的表达。结果表明,暗黑鳃金龟幼虫类钙粘蛋白基因cDNA序列全长4 833bp(GenBank登录号KM892868),其开放阅读框长4 503bp,编码1 501个氨基酸残基,预测蛋白分子质量169.967ku,理论等电点4.11。在幼虫不同发育时期和3龄幼虫的不同部位均有表达,且在不同时期、不同部位的表达量差异显著。比较不同龄期幼虫的表达量可知,3龄幼虫表达量最高,1龄幼虫表达量最低;比较3龄幼虫不同组织表达量可知,中肠表达量最高,前肠和后肠表达量较低,其他部位则基本不表达。

类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的影响

将克隆的黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达纯化,并分析其对Cry3A毒素杀虫活性的影响,从而探讨黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的增效作用。黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达产物为包涵体,经尿素变性后,用亲和纯化法可得到较纯的重组蛋白;随着类钙粘蛋白片段与Cry3A质量比值的升高,Cry3A毒素对黄粉虫的杀虫活性也逐步提高,当其比值为1时,活性达到最大,提高了2.5倍,而黄粉虫类钙粘蛋白片段对Cry3Am的杀虫活性却没有显著性影响。研究表明,黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素的杀虫活性具有增效作用。

甜菜夜蛾类钙粘蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

昆虫中肠膜上的类钙粘蛋白(cadherin-like protein)是Bt毒素的一类重要受体,它与Bt毒素对昆虫的杀虫作用机制以及昆虫对Bt毒素的抗性等密切相关。本研究根据已报道的其它昆虫的类钙粘蛋白基因的保守区设计简并引物,应用RT-PCR和RACE技术克隆了迁飞性重要害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)类钙粘蛋白基因全长cDNA序列(命名为SeCAD,GenBank登录号为HQ647122),全长5582bp,编码1739个氨基酸,推导的氨基酸序列包括1个信号肽、1个前蛋白区、11个钙粘蛋白重复、1个近膜区、1个跨膜区和1个胞质区。预测的分子量和等电点分别为196.447ku和4.47。该蛋白与同科的大螟Sesamia inferens、蛀茎夜蛾S.nonagrioides、烟芽夜蛾Heliothi svirescens、烟夜蛾Helicover paassulta亲缘关系更近,氨基酸序列一致性分别为61.28%、60.34%、60.14%、60.08%。这些结果对于揭示转Bt基因作物对非靶标、迁飞性甜菜夜蛾的杀虫作用机制以及评价其潜在的对Bt毒素抗性机制等奠定了基础。

Bt毒素相关受体的研究进展

最近,苏云金芽孢杆菌毒素相关受体的研究取得了一些突破,提出了Bt毒素新的作用模型,并发现了Bt毒素一类新的受体。本文综述了相关研究的最新进展。