甘蔗类钙调素ScCML13与SCMV运动蛋白P3N-PIPO的互作研究

类钙调素(Calmodulin-like,CML)是植物特有的钙信号感受器蛋白之一,参与植物生长发育和响应外界环境信号转导。甘蔗(Saccharum spp.hybrid)中CML应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)侵染尚未见报道。本研究从甘蔗热带种Badila(S.officinarum)中克隆了一个CML基因,命名为ScCML13。该基因开放读码框(open reading frame,ORF)长度为519 bp,编码172 aa。生物信息学分析表明,ScCML13属于稳定的亲水脂溶蛋白,无跨膜结构域,有4个结合Ca2+的EF-hand结构域;系统进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物中及单子叶C3和C_(4)植物中具有明显分化;酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验表明,ScCML13与SCMV的运动蛋白P3N-PIPO互作。亚细胞定位试验表明ScCML13定位于内质网和细胞核。共定位试验发现ScCML13会干扰SCMV-P3N-PIPO的质膜(plasma membrane)或胞间连丝(plasmodesmata)定位。实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR)分析发现,ScCML13基因主要在甘蔗叶片中表达,在节间和根中的相对表达量低;ScCML13基因在感染SCMV后2 h显著上调,随后下调至与对照组相比的水平,而在感染后期上调。

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5-Race和3-Race分别得到550bp和721bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~1078bp处,加尾信号（AATAAA）位于第1222bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55kD的融合蛋白。

小麦类钙调素TaCML79基因的克隆和表达分析

为了研究小麦类钙调素基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,在小麦中克隆到一个类钙调素基因TaCML79。该基因的开放阅读框长度为588bp,编码的蛋白长度为195个氨基酸,推测的分子量为20.45kDa,等电点为4.6,属于酸性蛋白,具有2个典型的和一个不完整的EF-hand结构域。多序列比对和系统进化树分析表明,TaCML79与野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10亲缘关系较近,相似性分别为84.6%和86.8%。该基因的表达在根和地上部分受到热激、NaCl、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,初步推断该基因可能与植物抗逆有密切的关系。

新疆无苞芥类钙调素蛋白基因OpCML13的克隆与分析

通过对无苞芥幼苗cDNA文库的随机克隆测序分析，获得1条与拟南芥编码类钙调素13（calmodulin-likel3，CMLl3）高度相似的EST（GenBank登录号为JZl52285）。利用RT-PCR技术从无苞芥cDNA中克隆了该基因，命名为OpCMLl3，该基因开放阅读框（ORF）为447bp，编码148个氨基酸。生物信息学分析表明，OpCMLl3蛋白的二级结构含有4个ca^2＋结合基序（EF-hands）结构，是一个亲水蛋白，无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白；同源建模发现该蛋白包含8个α-螺旋结构和10个β-转角。系统进化树分析表明，OpCMLl3编码产物与拟南芥AtCMLl3和AtCMI。14进化关系较近，属于同一进化分支。半定量RTPCR结果显示，OpCMLl3基因在无苞芥的不同组织中都有表达，在根中表达量最高；高盐胁迫处理6～24h，OpCMLl3基因的表达明显增强，随后逐渐恢复正常表达水平；低温、干旱和ABA处理6h后基因表达明显上调，并且一直保持较高的表达水平。研究表明，OpCMLl3基因在无苞芥逆境胁迫中可能起着重要作用。

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。

小麦类钙调素TaCML8-A基因的克隆和表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,研究类钙调素基因在植物抗逆反应的分子机制,利用电子克隆结合RT-PCR的方法克隆小麦类钙调素基因TaCML8-A。生物信息学分析显示,该基因的CDS区全长为519 bp,编码172个氨基酸,包含PTZ00184和FRQ1超家族,含有4个EF-hand结构域,其中包含4个钙离子结合位点;编码蛋白质分子质量为18.31 ku,等电点为4.54,属于酸性蛋白质。亚细胞定位结果显示,TaCML8-A蛋白质在细胞核和细胞膜中均有分布。核苷酸序列比对发现,TaCML8-A与水稻OsCML14亲缘关系最近,相似性为79.17%。qRT-PCR结果显示,在盐、渗透和冷胁迫处理中,TaCML8-A基因在小麦地上部分和根中的表达均上升,表明植物可能通过提高TaCML8-A基因的表达来响应盐、渗透和冷胁迫;热激时TaCML8-A基因在根和地上部分分别受到诱导和抑制,从而发挥不同的功能。从小麦中成功克隆出类钙调素基因TaCML8-A,并进行表达分析,初步推测该基因可能参与调控植物的非生物胁迫,其结果可为后续研究其生物学功能提供基础理论支撑。

植物类钙调素CML37的转录激活活性分析

植物类钙调素是细胞内重要的Ca2+感受器,在钙信号转导中发挥重要作用。拟南芥类钙调素CML37调节植物多种胁迫反应、促进干旱诱导的ABA合成,钙调素结合蛋白IQM4促进种子ABA合成,调节种子休眠与萌发。酵母双杂交分析表明CML37不是IQM4的结合蛋白,但CML37可能具有自激活功能;通过酵母单杂交实验证实拟南芥CML37蛋白具有转录激活活性。

植物类钙调素生理功能的研究进展

钙调素(也称钙调蛋白)是一种广泛存在于真核生物中的钙感受器,参与各种生理活动的信号转导.植物除了含有钙调素以外,还含有一类与钙调素同源性很高,但在结构上又不同于钙调素的蛋白,称为类钙调素(也称类钙调蛋白).近年来,人们在植物特有的类钙调素的功能研究方面取得了一些重要的进展.研究表明,类钙调素与钙调素一样,也具有广泛的生物学功能,参与植物生长发育和对各种胁迫的响应.本文就植物类钙调素与钙调素之间的区别、类钙调素与钙离子及靶蛋白的结合,以及类钙调素的各种生理功能进行总结.

巴西橡胶树类钙调素蛋白基因HbCML27克隆与表达分析

类钙调素蛋白(Calmodulin-like proteins,CMLs)在植物钙信号转导中发挥重要作用。本研究采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法,从巴西橡胶树中克隆了CML基因Hb CML27。Hb CML27开放阅读框长度为450 bp,编码149个氨基酸。预测Hb CML27蛋白分子量为16.55 k D,等电点为4.10,是一个亲水蛋白。Hb CML27蛋白含有4个保守的EF-hand钙结合结构域,与其它植物CML27蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,在巴西橡胶树叶片、花、根、树皮及胶乳等组织中均有Hb CML27基因表达,其中,表达量最低的组织是叶片,表达量最高的组织是胶乳。同健康橡胶树胶乳相比,Hb CML27在死皮橡胶树胶乳中的表达量降低。伤害、过氧化氢(H2O2)、乙烯利、茉莉酸甲酯(Me JA)、低温及干旱等处理均能上调Hb CML27的表达。这些结果表明Hb CML27可能参与了巴西橡胶树产排胶调控及响应非生物逆境胁迫。

小报春类钙调素蛋白基因PfCML41的克隆及序列分析

CMLs是一类钙离子传感器,能与Ca2+结合,对促进花粉萌发和花粉管生长发挥重要作用。为了探究CMLs对小报春(Primula forbesii)异型自交不亲和系统的影响,在小报春以长花柱做母本时的亲和授粉与不亲和授粉的转录组数据中发现了一个差异表达基因PfCML41,并对其进行了CDS序列全长克隆和基因序列分析。结果表明,PfCML41基因的CDS序列全长为555 bp,编码184个氨基酸。编码的蛋白无信号肽和跨膜区域,属于亲水性蛋白。PfCML41含有EF-hand结构,能与Ca^(2+)结合。通过系统进化树分析,PfCML41与茶(Camellia sinensis)的CsCML41亲缘性更近。实时荧光定量PCR结果表明PfCML41在不亲和授粉组合中的相对表达量高于亲和授粉组合,且差异显著。本研究为小报春PfCML41的表达分析与功能验证提供了理论依据。

皮肤特异表达钙调素类蛋白研究进展

钙调素是广泛存在于各种动植物细胞的信号转导分子,近年在皮肤中发现了一些钙调素类蛋白,其分布、特征、功能都与钙调素不同,在表皮的分化发育中发挥重要作用。本文就此作一简单介绍。

杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区的表达与纯化

目的:构建杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区(KMD)基因原核表达载体并表达纯化KMD。方法:通过软件和在线工具预测KMD的理化性质。构建KMD的原核表达载体pET28a-KMD,而后在大肠杆菌BL21(DE3)内16℃过夜诱导表达KMD,通过超声破碎菌体和高速离心,将上清液进行亲和层析,获得粗纯目的蛋白,再利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。SDS-PAGE检测层析各阶段蛋白样品。将纯化后的KMD均分3份分别放置在-80℃、4℃和18℃环境中,1周后SDS-PAGE检测目的蛋白是否降解。结果:KMD相对分子质量为37480,预测pI为7.99。基因中含有的稀有密码子不会明显影响其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多步层析后可以获得2个独立的目的蛋白洗脱峰,均为KMD且纯度可满足结晶条件搜索。纯化后的KMD在4℃和18℃下放置1周后无降解。结论:获得大量高纯度、均一性良好的KMD蛋白,能够满足培养蛋白晶体所需。

棉花CML基因家族成员鉴定与功能分析

【目的】类钙调素(Calmodulin-like,CML)蛋白是1种重要的Ca2+传感器,在调节植物应激反应机制中起重要作用。对CML基因家族进行全基因组学分析,以便深入研究CML基因在棉花逆境胁迫下的作用。【方法】利用生物信息学的方法进行了棉花CML家族成员的鉴定。利用转录组数据和反转录聚合酶链式反应分析陆地棉(Gossypium hirsutum L.)CML基因在盐胁迫下的表达模式。利用病毒诱导基因沉默技术对GhCML44-2基因进行沉默并进行功能验证。【结果】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、亚洲棉(G. arboreum L.)中分别获得了154个、74个、78个CML蛋白。进化树和保守基序分析表明,GhCML蛋白分为8个亚类,都含有保守的EF-hand结构域;在盐胁迫下,107个GhCML基因在叶和根中有显著的差异表达,且在根和叶中的差异表达模式不同。启动子分析表明,这些基因启动子中存在多种不同的胁迫响应元件;利用病毒诱导基因沉默技术成功沉默GhCML44-2的棉株相较于对照更加不耐盐。【结论】该研究结果有助于了解棉花CML基因家族的进化与功能,为后续研究其功能提供了一定的理论依据。

天山雪莲SikCML7的克隆及表达分析

类钙调素蛋白(Calmodulin-like protein)是高等植物中最重要的Ca2+感受器之一,该家族蛋白参与植物对环境的适应过程。为了探究类钙调素蛋白是否参与到植物对逆境条件的响应过程,以天山雪莲低温转录组为依据,克隆获得SikCML7,生物信息学分析表明SikCML7 的开放阅读框(ORF)为450 bp,编码149 个氨基酸,含有4 个钙结合区域(EF-hands)。系统进化树分析表明SikCML7 与拟南芥AtCML9 进化亲缘性较为接近。实时定量PCR 结果显示,天山雪莲在经过不同低温(4℃/-2℃)、干旱和盐胁迫处理后,SikCML7 的表达均呈上调趋势,但在冷害胁迫和冻害胁迫条件下的表达模式差异巨大,对干旱和盐胁迫也有一定的响应。SikCML7 参与了天山雪莲对低温、干旱和盐胁迫响应的过程。

杜氏盐藻cDNA文库的构建及KCBP基因的克隆

目的:构建杜氏盐藻cDNA文库并从该文库中筛选类驱动蛋白钙调素结合蛋白(KCBP)基因cDNA序列。方法:取对数生长期的杜氏盐藻细胞,提取总RNA并分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,连接到pAP3neo载体上,采用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B。计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。运用PCR法筛选含有KCBP基因特异片段的质粒。结果:文库滴定度为5.6×106pfu/mL,重组率在90%左右,插入片段长度在0.4～6.0kb,平均长度为1.9kb。利用PCR法从该文库中筛选到了含有新基因KCBP特异片段的单菌落,经测序与cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR获得的杜氏盐藻KCBP基因cDNA序列相符,此序列属于kine-sin-14家族。结论:成功构建杜氏盐藻cDNA文库,并从该文库筛选出一个kinesin样cDNA序列。

细胞外信号调节激酶通路抑制剂对完全弗氏佐剂致痛大鼠背根神经结中谷氨酸转运蛋白表达的影响

目的:观察细胞外信号调节激酶(ERK)通路抑制剂PD98059对完全弗氏佐剂(CFA)致痛大鼠脊髓背根神经结(DRG)中谷氨酸转运蛋白表达的影响。方法:24只大鼠随机分为对照组、单纯致痛组、PD1组和PD10组。疼痛模型采用大鼠足底注射CFA100μL。对照组及单纯致痛组经椎管内给予二甲基亚砜(DMSO)10μL,每日2次。PD1组和PD10组分别经椎管内给予PD980591μg或10μg,每日2次。测定大鼠每日痛阈变化,3d后RT-PCR法检测大鼠DRG内谷氨酸转运蛋白表达的变化。结果:注射CFA致痛后各组大鼠痛阈均显著降低,PD1组与PD10组大鼠痛阈均较单纯致痛组显著升高,PD1组与PD10组痛阈升高差异无显著性。单纯致痛组DRG中谷氨酸转运体1(GLT-1)和兴奋性氨基酸载体1(EAAC1)表达显著高于对照组、PD1组、PD10组。除PD1组DRG中GLT-1表达高于对照组外,PD1组、PD10组及对照组DRG中GLT-1与EAAC1表达差异无显著性。结论:鞘内给予PD98059可减轻大鼠足底注射CFA引起的疼痛反应并减低致痛侧DRG中谷氨酸转运蛋白表达。

木薯钙/CaM调控类受体激酶基因MeCRLK1的克隆及生物信息学分析

木薯作为热带亚热带植物对低温非常敏感。为研究木薯对低温敏感的分子机制,我们从低温信号传导途径中的感知方面展开研究。植物类受体激酶作为信号传导途径中的信号接收器,在植物响应低温信号刺激过程中起重要作用。因此本研究利用RT-PCR从木薯栽培种SC8中克隆了一个钙/钙调素调控类受体激酶基因,命名为Me CRLK1(Gen Bank Accession No.KP256022)并进行了系统的生物信息学分析。研究结果表明该基因CDS区为1 296 bp,编码一个431 aa的蛋白。该蛋白的分子式为C_(2118)H_(3391)N_(605)O_(636)S_(18),分子量约为48.08 k D,理论等电点为8.11。该蛋白预测具有多个不同的磷酸化位点,3个Ca M结合位点,4个紊乱区和1个球蛋白区。蛋白结构分析表明该蛋白具有一个跨膜区,一个S_TKc结构域,N末端没有信号肽。预测此蛋白可能亚细胞定位于膜上。Me CRLK1和At CRLK1蛋白序列分析表明,它们的相似性为79.8%,序列一致性为77.6%。二者序列的差异主要位于C末端。该研究结果为进一步验证Me CRLK1基因的功能奠定了基础。

中央杏仁核钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα在芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的作用：与mEPSCs的关系

目的 评价中央杏仁核钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡα）在芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的作用及其与微小自发性兴奋性突触后电流（mEPSCs）的关系.方法 清洁级健康雄性SD大鼠,体重50～ 80 g,中央杏仁核立体定位置管成功的大鼠32只,采用随机数字表法分为4组（n=8）：对照1组（C1组）皮下注射生理盐水,中央杏仁核给予二甲基亚砜;芬太尼诱发痛觉过敏1组（FIH1组）皮下注射芬太尼（每次60 μg/kg,共4次,每次间隔15 min,累积给药240 μg/kg）制备大鼠痛觉过敏模型,中央杏仁核给予二甲基亚砜;KN92组制备模型后中央杏仁核给予CaMKⅡα抑制剂KN92 10 nmol;KN93组制备模型后中央杏仁核给予KN93 10 nmol.于芬太尼或生理盐水注射后6和7h时测定机械痛阈和热痛阈.另取大鼠12只,采用随机数字表法分为2组（n=6）：对照2组（C2组）和芬太尼诱发痛觉过敏2组（FIH2组）分别于颈部皮下注射生理盐水和芬太尼（方法同上）,12h后制备脑片,记录mEPSCs的频率和强度,随后在脑片人工脑脊液中加入KN93 10 nmol,记录mEPSCs的频率和强度.结果 与C1组比较,FIH1组、KN92组和KN93组芬太尼或生理盐水注射后6h时、FIH1组和KN92组芬太尼或生理盐水注射后7h时机械痛阈和热痛阈降低（P＜0.05）;与FIH1组比较,KN93组芬太尼或生理盐水注射后7h时机械痛阈和热痛阈升高（P＜0.05）,KN92组差异无统计学意义（P＞0.05）.与C2组比较,FIH2组给予KN93前mEPSCs频率和强度增加（P＜0.05）,给予KN93后mEPSCs频率和强度差异无统计学意义（P＞0.05）;与给予KN93前比较,C2组给予KN93后mEPSCs频率和强度差异无统计学意义（P＞0.05）,FIH2组给予KN93后mEPSCs频率和强度降低（P＜0.05）.结论 CaMKⅡα激活增强神经元突触兴奋性参与了芬太尼诱发大鼠痛觉过敏的过程.

山葡萄VaCBL6参与非生物胁迫和ABA途径的响应

对山葡萄(Vitisamurensis)‘左山-1’中的1个类钙调素磷酸酶B亚基蛋白基因VaCBL6进行克隆及功能分析。VaCBL6位于第4条染色体,开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;结构域分析表明,该蛋白包含4个EF-hand与1个跨膜结构域;蛋白进化树分析表明,VaCBL6与欧洲葡萄VvCBL9和VvCBL6相似性较高,分别为98.84%、94.96%。VaCBL6编码蛋白定位于细胞核与细胞膜。VaCBL6在根与卷须中有较高的表达,且其表达受低温、干旱、NaCl和ABA的诱导。基于酵母体系的转录激活分析表明,VaCBL6无转录激活活性。100~125μmol·L^(-1) NaCl和0.25~1.25μmol·L^(-1) ABA处理均抑制了VaCBL6转基因拟南芥种子的萌发,且转化拟南芥幼苗对NaCl与ABA的敏感性提高。以上结果说明VaCBL6在植物的逆境胁迫应答中具有重要作用。

子宫颈脱落细胞中DAPK1、RAR—β和MGMT基因启动子的甲基化水平及其临床意义

目的检测宫颈脱落细胞中DAPK1、RAR-β、MGMT基因启动子的甲基化水平，探讨其筛查高级别宫颈病变[包括宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅱ、Ⅲ]及宫颈鳞癌的价值。方法采用简单随机法选取2010年3-10月间北京协和医院临床使用后剩余的宫颈脱落细胞标本共103份，其中，细胞学诊断包括正常宫颈细胞12份、不典型鳞状上皮细胞（ASC）17份、低度鳞状上皮内病变（LSIL）30份、高度鳞状上皮内病变（HSIL）30份、宫颈鳞癌14份；组织学诊断包括正常宫颈组织27份、CINI19份、CINⅡ17份、CINⅢ25份、宫颈鳞癌15份。采用甲基化特异性高分辨率熔解曲线分析（MS—HRM）法检测宫颈脱落细胞中DAPKl、RAR—B、MGMT基因启动子的甲基化率，并评价MS．HRM法检测的敏感性；采用第二代杂交捕获技术（HCⅡ）检测宫颈脱落细胞中高危型HPV载量（以HPV-HCⅡ值表示）；评价DAPK1、RAR—β、MGMT基因启动子的甲基化和HCⅡ单独或联合检测筛查高级别宫颈病变及宫颈鳞癌的价值。结果MS—HRM法可以检测出标准样本中的1％DNA甲基化率。在不同细胞学病变中，DAPK1、RAR—β、MGMT基因启动子的甲基化率分别比较，差异均有统计学意义（P值分别为0．000、0．011、0．002）；在不同组织学病变中，DAPK1和RAR-β基因启动子的甲基化率分别比较，差异均有统计学意义（P值分别为0．000、0．021）。高级别宫颈病变＋宫颈鳞癌与正常宫颈＋CINI组织中DAPK1基因启动子的甲基化率分别为1．47％和20．98％，两者比较，差异有统计学意义（P=0．000）。DAPK1基因启动子的甲基化检测筛查高级别宫颈病变及宫颈鳞癌的灵敏度为0．571、特异度为0．791，曲线下面积（AUC）为0．709；DAPK1基因启动子的甲基化联合HCⅡ检测的灵敏度为0．825、特异度为0．565，AUC为0．695。结论MS—HRM法检测宫颈脱落细胞的甲基化水平是可行的。DAPK1、RAR—β基因启动子甲基化可以作为筛查宫颈病变的分子标记。DAPK1基因启动子的甲基化联合HCⅡ检测有助于筛查高级别宫颈病变及宫颈鳞癌。