茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。

植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展

植物类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)属转移酶类的甲基转移酶家族,是一类可催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)中的-CH3基团转移到类黄酮-OH上的蛋白质酶。甲基化是类黄酮物质最基本、最主要的修饰反应之一,不仅可以降低类黄酮的化学反应活性,而且增加了其脂溶性,赋予了类黄酮更多的生理生化特性。该文对近年来国内外有关类黄酮甲基化对植物中FOMT催化的生理生化代谢反应、FOMT的分类、FOMT酶蛋白结构域、生物学功能以及FOMT基因克隆与表达调控等方面的研究进展进行综述,为植物类黄酮更广泛、更深入的研究提供新的思路与途径。

马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析

根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花色苷的积累是相关的。

银杏类黄酮O-甲基转移酶活性的高效液相色谱分析

首次明确了银杏叶片类黄酮生物代谢关键酶O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)活性的HPLC测定技术与方法。采集扬州大学银杏种质资源圃银杏雄株成熟叶片,提取粗酶液,根据FOMT催化反应生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的原理,以山奈酚、槲皮素和异鼠李素等3种黄酮苷元为反应底物,采用优化的HPLC体系检测样品中FOMT催化反应生成的SAH峰面积,通过标准曲线求得不同反应底物的FOMT相对活性。FOMT活性反应生成物SAH在1.5～20μg/mL内呈良好的线性关系,RSD为2.1%(n=5),建立了FOMT活性测定优化体系。不同反应底物的FOMT活性表现不同,山奈酚与异鼠李素显著高于槲皮素。FOMT活性HPLC测定方法准确、快速、可靠、灵敏度高。

类黄酮3',5'羟基化酶基因的克隆及转化铁炮百合

利用RT-PCR技术从矮牵牛的紫色花瓣中克隆了两个控制花色的类黄酮3,5羟基化酶基因Hf1和Hf2,并构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法对铁炮百合进行了遗传转化,获得了转基因植株。

大肠杆菌表达类黄酮O-甲基转移酶合成槲皮素甲基化衍生物

槲皮素是一种重要的柑橘类黄酮,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生物学活性,但水溶性和脂溶性较差,研究表明可通过甲基化提高其代谢稳定性和生物利用度,目前微生物转化法是获得甲基化槲皮素的良好方法。作者筛选了11种不同来源的类黄酮O-甲基转移酶(FOMT),并根据甲基化位点进行分类构建相应的大肠杆菌工程菌,以槲皮素为底物进行发酵分别合成了4种单O-甲基槲皮素(柽柳黄素、鼠李素、异鼠李素和3-O-甲基槲皮素),最高产量分别为31.17、11.17、8.90、52.95 mg/L。随后构建了大肠杆菌共培养体系,分步添加含有MpOMT4和OsNOMT的重组大肠杆菌全细胞催化剂,并通过调整体系中两种菌体的比例和生物量,最终确定菌体细胞质量浓度为24 g/L(以细胞干质量计)、两种菌体质量比为1∶2时,4′,7-二甲氧基槲皮素的最高产量为21.56 mg/L。

绿色棉纤维类黄酮3',5'羟基化酶基因GhF3'5'H的克隆及实时定量表达分析

以发育18 d的天然绿色棉及其近等基因系白色棉纤维细胞为材料,利用cDNA-AFLP结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了1个绿色棉纤维优势表达基因的全长cDNA。序列分析结果表明,该cDNA全长1873bp,含有一个编码509个氨基酸残基的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个类黄酮3',5'羟基化酶,将该基因命名为GhF3'5'H,序列提交到GenBank,登录号为GU062184。实时荧光定量PCR检测结果显示:GhF3'5'H在绿色棉不同组织中的表达量均显著高于其近等基因系白色棉,而且主要在纤维细胞中表达。在纤维发育过程中,GhF3'5'H在纤维发育的早期表达量最高,并随纤维发育逐渐降低。推测该基因可能在绿色棉纤维色素前体物质的形成中发挥作用。

类黄酮3′,5′羟基化酶基因的克隆及转化矮牵牛

类黄酮3’,5’羟基化酶(Flavonoid 3’,5’-hydroxylase,F3＇,5＇H)是花色素苷代谢途径中的一个关键酶,它使花色素的合成方向趋向于形成蓝色色素翠雀素。利用PCR方法,从“紫蓝色”品系的矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA中,克隆到编码F3’,5＇H的Hf1、Hf2基因。将Hf2基因正向插入到植物表达中间载体中,通过土壤农杆菌介导的方法转化“淡粉色”品系的矮牵牛。现已得到PCR阳性植株。

锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的生物信息学分析

类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是类黄酮代谢途径的一个关键酶,能使花色素的合成方向趋向于蓝色的飞燕草素。利用生物信息学软件对锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(RpF3′5′H)进行分析。结果显示,RpF3′5′H基因ORF长1551 bp,共编码516个氨基酸;分子量为57.31 kD,等电点为9.03,无信号肽,定位于细胞质中的可能性最大,二级结构与三级结构中含有较多的α螺旋,与高丛越橘有较高亲缘性。分析结果将对RpF3′5′H的功能解析奠定理论基础,同时也为探究锦绣杜鹃花色苷的生物合成有一定指导作用。

艾叶类黄酮O-甲基转移酶基因家族的鉴定及表达分析

艾(Artemisia argyi)以叶片入药,为我国常用大宗中药材,主要活性成分为挥发油、黄酮等化合物,具有多种药理活性。目前鉴定到的艾叶黄酮类物质多为氧甲基化修饰,而类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物氧甲基化修饰的关键酶。为进一步了解FOMT蛋白功能及特性,本研究对艾中FOMT基因家族进行了全基因组的挖掘和鉴定,并进行系统发育、染色体定位、基因序列特征、亚细胞定位预测、蛋白结构、基因结构分析及表达模式的分析和验证。结果表明,在艾的基因组中,共鉴定得到83个FOMT基因,系统发育树显示FOMT基因分为CCoAOMT(caffeoyl CoA O-methyltransferase)亚家族(32个基因)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)亚家族(51个基因)两个亚类。基因序列特征分析显示FOMT编码氨基酸的数目介于70~734 aa,分子质量为25296.55~34241.3 Da,等电点为4.51~9.99,与32个CCoAOMT亚家族成员相比,51个COMT亚家族成员中,约1/3的FOMT蛋白为疏水性蛋白,2/3蛋白为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示超过80%的CCoAOMT亚家族成员定位于细胞质,96%的COMT亚家族成员定位于叶绿体。COMT成员相对CCoAOMT成员motif数较多,且位于N端的motifs变异相对较大,位于C端的motifs相对保守;表达模式分析显示CCoAOMT亚家族成员主要在根中表达,而COMT成员主要在叶片中高量表达;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了部分FOMT在叶片中优势表达,具有组织表达特异性。本研究对艾叶FOMT基因家族进行鉴定与分析,为进一步深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物

【目的】操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶,生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。【方法】构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因(CsF3′H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1–S12;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒p YES-Dest52-CsF3′H,转化酵母菌株WAT11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒pES-URA-CsF3′H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因At FLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::At FLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT11,获得转化菌株S14。【结果】转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25°C条件下发酵,转化效率最高,能将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93μmol/L圣草酚、131.76μmol/L二氢槲皮素和188.62μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32μmol/L圣草酚、446.07μmol/L二氢槲皮素和594.64μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36–48 h中,最多能生成1412.16μmol/L圣草酚、490.25μmol/L山奈酚、445.75μmol/L槲皮素、66.75μmol/L二氢槲皮素和73.50μmol/L二氢山奈酚。【结论】本研究首次将茶树类黄酮3′-羟基化酶基因应用于B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。

黄草乌Av-F3'5'H基因的克隆与表达分析

根据已发表的川乌头F3'5'H基因序列,通过RT-PCR方法从黄草乌(Aconitum vilmorinianum)花朵中克隆到了1个类黄酮3',5'羟基化酶(F3’5’H)基因的c DNA序列,该序列长1563 bp,包含1个编码506个氨基酸的完整开放阅读框,命名为Av-F3'5'H(Gen Bank登录号:JQ806761)。序列比对分析显示Av-F3'5'H蛋白与其它物种的F3'5'H蛋白序列有很高的序列相似性,包含有已确定的CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等保守基序等。以川乌头18sRNA基因(FJ748878)为内参,通过RT-PCR对Av-F3'5'H基因的时空表达模式进行了分析,结果显示Av-F3'5'H基因的表达水平随花朵发育进程而呈递增趋势,在第3时期的花朵中达到最高,随后又逐渐降低,而在根、茎和叶中均不表达,推测该基因可能在调节黄草乌花朵蓝色形成过程中起重要作用。

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。

矮牵牛编码F3′5′H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3′,5′羟基化酶(Flavonoid-3′,5-′hydroxylase,F3′5′H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移。本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3′5’H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛。抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株。

Application of Cellulase-assisted Method to Extract Flavonoids from Plants

The extraction mechanisms of cellulase-assisted extraction technology in extracting flavonoids were summarized, as wel as its application in extracting flavonoids from the plants of Leguminosae, Ginkgoaceae, Rutaceae and Labiatae. In addition, the progress in the extraction of flavonoids by combining cellulase-assisted extraction technology and other technologies, such as cellulase-ultrasonic assisted extraction and cellulase-microwave assisted extraction, were described.

矮牵牛F3′,5′H全长cDNA的克隆及花特异启动子介导表达载体的构建

通过RT-PCR从蓝色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆类黄酮-3',5'-羟基化酶基因(F3',5'H)全长cDNA(GenBank登记号EF371021)。生物信息学分析表明克隆的F3',5'H基因与GenBank登记号D14588、Z22545和DQ352142等的F3',5'H基因序列高度一致;其编码的氨基酸序列与GenBank登记号BAA03438.1(矮牵牛)、BAC10997.1(银杯草)和AAV85470.1(马铃薯)的高度同源,同源率分别为99%、88%和87%。利用pBIN19、pBluescript SK(+)和pMD18-PchsA质粒成功构建了花特异性启动子PchsA驱动的F3',5'H基因的表达载体pBIN19-PchsA-F3'5'H,并导入到野生型发根农杆菌K599中。利用K599诱导菊花生根,不定根的诱导率可达30.7%。这为利用转基因技术创造蓝色花卉提供了重要的基础。

青稞OMT1基因克隆及原核表达分析

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)是一种在植物甲基化黄酮代谢合成中有着重要作用的酶,但在中国青藏高原的特色作物青稞中研究较少。为了更好了解该酶及编码基因在青稞中的生理功能及作用,以高总黄酮青稞品系94-19-1为材料,通过RT-PCR扩增、克隆得到青稞OMT1基因的ORF序列。结果表明,该基因ORF长1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量为38.65 KDa,等电点为5.33。序列比对分析发现,所克隆的基因与NCBI数据库收录的大麦Hv OMT1基因有99.44%的一致性,氨基酸序列存在5个残基差异,编码的蛋白序列具有OMT蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体转化大肠杆菌,最终成功将该基因所编码的蛋白在大肠杆菌诱导表达,并利用亲和层析柱分离技术,将该表达蛋白进行了纯化。这为进一步研究该酶蛋白功能和选育高品质青稞品种奠定了基础。

青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析

类黄酮7-O-甲基转移酶(F7-OMT)具有甲基转移酶功能,能催化底物类黄酮甲基化产生植物抗毒素,提高植物的抗菌性。为了给进一步研究该酶蛋白的功能奠定基础,以青稞"94-19-1"为材料,采用同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因编码片段。生物信息学分析表明,青稞F7-OMT开放阅读框(ORF)全长为1173bp,编码390个氨基酸,蛋白分子质量为42 207.8Da,等电点pI为5.36,无信号肽序列,具有甲基转移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通过亚克隆将F7-OMT连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。

非洲紫罗兰F3′5′H基因的克隆及烟草的转化分析

本研究利用PCR技术克隆了非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）花色合成的关键酶,F3＇5＇H的基因.对克隆序列的分析表明,F3＇5＇H基因序列上非洲紫罗兰与金鱼草（Antirrhinum Kelloggii）、矮牵牛（ToreniaH ybrida）有着较近的亲缘关系.构建了该基因的pCAMBIA1304表达载体,采用农杆菌介导叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）,获得了转基因植株.利用高效液相色谱法（HPLC）法检测转基因植株类黄酮含量,转基因烟草类黄酮相对含量升高4.0％～16.3％,同时花色向紫色转变.表明该基因对植物花色的形成有重要作用,可为基因工程蓝色花育种提供理论依据和基础.