中国水仙类黄酮3-氧-葡糖基转移酶基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙上分离克隆得到1个葡糖基转移酶基因,命名为Nt3GT,其cDNA全长1 682bp,包含有1个1 461bp完整阅读框架(ORF),编码487个氨基酸,具有Glycos_tranf_1superfamily蛋白保守区。系统进化分析表明,中国水仙与马铃薯属的3GT亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,Nt3GT在叶片和花中均有表达,各个时期的叶片中表达量稳定,但花中的表达量不稳定,在抽葶期花苞未检测到表达,在盛花期的表达最高。

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。

山葡萄类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的表达分析

为了探究VAm3GT蛋白表达和在山葡萄体内酶学特征及生物学功能,进一步证实克隆所获得目的基因的准确性。利用实时定量PCR法对山葡萄果皮8个不同转色时期类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(VAm3GT)的表达量进行了分析,并通过双酶切、连接转化等方法将VAm3GT基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建原核表达重组质粒pET28a-VAm3GT。重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析表明,在适宜的IPTG诱导浓度下,VAm3GT基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为50.19 ku,成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达。

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花>果实>茎>叶>根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T3代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。

霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶(DhUF3GT)基因克隆与原核表达分析

目的 克隆霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶(DhUF3GT)基因并进行生物信息学分析,为进一步培育高黄酮含量的霍山石斛药材提供理论依据。方法 根据前期霍山石斛转录组数据筛选出的基因DhUF3GT,克隆该基因,并对cDNA的核酸序列进行生物信息学分析,同时构建DhUF3GT-pET28(a)重组质粒进行原核表达分析。结果 测序结果显示,霍山石斛DhUF3GT基因cDNA序列有1289 bp,包含一个长度为1239 bp的开放阅读框,编码412个氨基酸,GenBank中的登录号为OM460827。生物信息学分析表明:DhUF3GT蛋白属于亲水性稳定蛋白,理论相对分子质量为45.668 KD,等电点(PI)为5.98,具有多个磷酸化位点和两个糖基化位点,不含信号肽,亚细胞定位于叶绿体。系统进化树表明,该序列与同科植物铁皮石斛同源性最高,具有UGT家族的“PSPG Box”保守区域。SDS-PAGE电泳显示,成功表达出原核重组蛋白DhUF3GT-pET28(a)。结论 成功克隆出霍山石斛DhUF3GT基因序列,并获得其序列特征及原核表达蛋白,这有助于霍山石斛DhUF3GT功能的进一步研究及类黄酮化合物的生物合成机制的阐明。

山葡萄UDP-葡萄糖:类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)cDNA的克隆和分析

用RT-PCR和SMARTRACE技术克隆了山葡萄3GT基因的全长cDNA序列。GenBank登录号为FJ169463,3GTcDNA全长1477bp,包括开放阅读框1371bp,编码456个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为50.19kDa,等电点为5.98,是不稳定蛋白。该基因属于UGT超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AB047098)、美洲种葡萄(EF630356)和拟南芥(AY072325)等植物的3GT氨基酸序列的同源性系数分别为98%、97%和59%。

彩色马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)的生物信息学和表达分析

类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）能催化无色的花色素生成有色的花色苷。本研究采用RT-PCR法从彩色马铃薯中克隆了3GT基因,并对其进行了生物信息学分析和组织表达模式分析。结果显示,3GT基因编码448个氨基酸残基,具有信号肽但无跨膜结构域,还有一定的亲水性,定位于细胞质。同源比对表明3GT与茄子等茄科植物同属一簇,亲缘关系最近,与玉米等单子叶植物亲缘关系较远。3GT蛋白主要的二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,且只有一个功能结构域,即氨基酸序列中的93~407区段,它与UDP-glucoronosyl、UDP-glucosyl transferase的功能结构域相匹配,因此,3GT属于UDPGT型糖基转移酶超家族的一员。组织特异性表达结果表明：3GT相对表达量和花色苷含量均是块茎高于叶片,它们的变化趋势基本一致,花色苷含量较高的器官,其3GT的相对表达量也较高,说明花色苷的积累与3GT的表达正相关。本研究可为花色苷积累的生化及分子机制研究奠定基础,并为进一步研究该基因在花色苷合成途径中的调控功能提供理论依据。

青叶胆化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

目的运用超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)技术对中药青叶胆Swertia mileensis的主要化学成分进行定性分析。方法采用ACQUITY HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,体积流量为0.4 m L/min,质谱使用ESI离子源,正负离子模式下采集数据,运用Masslynx4.1软件并结合Sci Finder数据库、獐牙菜属相关文献以及对照品信息进行数据分析。结果从青叶胆中鉴定出化学成分28个,包括7个环烯醚萜类、14个酮类、3个黄酮类、2个三萜类以及2个酚类。其中断马钱子苷半缩醛内酯、8-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1,7-二羟基-3-甲氧基酮、3-氧去甲双酮苷和sweriyunnanlactone A为首次从该植物中发现。结论 UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能够快速准确地鉴定青叶胆中的化学成分,为其质量控制和药效物质基础研究提供一种新的研究策略。