过量表达紫茎泽兰类黄酮3’-羟化酶基因对转基因烟草POD、PAL活性的影响

紫茎泽兰具有强烈的化感作用,可抑制周围其他植物生长。类黄酮3’-羟化酶(F3’H)属于细胞色素P450(CYP)单加氧酶,具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能,在植物化感作用中行使一定的功能。利用转F3’H基因的烟草为实验材料,分别测定转F3’H基因植株、转pB I121空载体植株和野生型植株的过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,结果表明,转F3’H基因植株的POD活性分别是野生型植株和转空载体植株的3.8倍和2.0倍,而PAL活性则相应为4.0倍和2.0倍。由此推断F3’H基因在抵御伤害方面具有重要作用。

茶树类黄酮3’,5’-羟化酶在大肠杆菌的表达和优化

儿茶素是茶叶主要特征和功能成分之一,其中B环三羟基儿茶素约占儿茶素总量的65%以上。类黄酮3’,5’-羟化酶是类黄酮合成中B环5’羟基化的唯一酶系,与B环三羟基儿茶素合成积累密切相关。采用RACE技术,克隆了茶树类黄酮3’,5’-羟化酶基因的1 944 bp的全长序列,开放阅读框区域为55～1 587 bp,编码510个氨基酸,推测其分子量为57.1 kDa,等电点为9.06。该基因重组至pET-32a(+)表达载体上,在大肠杆菌Rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中温度诱导条件;利用钴离子吸附柱纯化了目的蛋白。该研究为开展F3’5’H酶的反应动力学、酶的器官组织定位等研究奠定了基础。

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。

鲜切荸荠类黄酮3’-羟化酶分离纯化及其动力学性质

以鲜切荸荠为材料,通过p H 7.5 Tris-HCl缓冲液浸提得到类黄酮3’-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase,F3’H)粗酶液,然后采用硫酸铵分级沉淀、透析、二乙氨乙基(dicthylaminoethyl,DEAE)-纤维素离子交换层析及Sephadex G-100凝胶过滤层析进行分离纯化,最终所得纯化酶的纯化倍数达到14.01,比活力提高到478.49 U/mg,回收率为6.38%。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行纯度鉴定,已达到电泳纯,测定得到其分子质量约为53.09 k D。纯化酶F3′H的最适温度为30℃,最适p H值为7.5;以柚皮素作为底物,测得该酶的米氏常数(K_m)为1.08 mmol/L,最大反应速率(v_(max))为416.67 U/(min·m L);对于酶活性,高浓度的Na+表现出微弱的抑制作用,Ca^(2+)和柠檬酸具有强烈的抑制作用,而Fe^(2+)、Mg^(2+)、NADPH和VC却表现出强烈的激活作用。

比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

一个类黄酮3'-羟化酶参与多星韭花色素生物合成的功能解析

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)在花色素苷生物合成过程中起关键作用。明确多星韭F3'H在花色素苷生物合成中的功能,将为多星韭花色形成及改良研究提供基因资源。基于转录组数据从多星韭花朵中克隆获得AwF3'H,并对其进行生物信息学分析,利用Real time PCR对AwF3'H1的表达模式进行分析,并利用蘸花法将AwF3'H转入拟南芥中,同时对转基因植株进行表型观察及花色素苷检测分析。结果表明,Aw F3'H的ORF全长为1545 bp,编码514个氨基酸,属于细胞色素P450家族成员,与洋葱AcF3'H的亲缘关系最近;在所检测组织均有表达,但在雄蕊中表达最高,根中表达最低;与野生型拟南芥相比,转AwF3'H拟南芥T2代幼苗子叶及下胚轴颜色明显加深,矢车菊素与天竺葵素类花色苷积累量显著增加。表明AwF3'H具有类黄酮3'-羟化酶的功能。

植物类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因的研究进展

本文介绍了植物F3’H基因的克隆、序列分析、表达分析、系统进化及转录调控的研究进展。

山葡萄中类黄酮3’-羟化酶基因(F3’H)cDNA的克隆和分析

用RT-PCR和SMART RACE技术克隆了山葡萄F3’H基因的全长cDNA序列。其GenBank登陆号为FJ645766,F3’HcDNA全长1844bp,包括开放阅读框1530bp,编码509个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为56.14kDa,等电点为8.24,是不稳定蛋白。该基因属于P450超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AJ8803537)、矢车菊(FJ753550)、金鱼草(DQ272592)、大豆(AB061212)和玉米(EU966228)等植物的F3’H氨基酸序列的同源性系数分别为98%、77%、72%、74%和57%。

芜菁的类黄酮3'羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性

用UV-A处理‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁块根24h后提取总RNA,以RT-PCR方法分别克隆到BrF3'H1和BrF3'H2基因。BrF3'H1和BrF3'H2的开放读码框为1536bp,均编码511个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3'H1和BrF3'H2与甘蓝型油菜F3'H的同源性达99%,在第45～476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域。BrF3'H1和BrF3'H2基因有高度同源性,核苷酸序列的17个位点处有差异,推导的氨基酸序列在5个位点处有差异。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3'H1表达,基因的表达量与UV-A处理时间呈相关,UV-A不能诱导BrF3'H2基因表达。

银杏类黄酮3’羟化酶基因的克隆与表达分析

利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中分离到黄酮3’羟化酶基因Gb F3’H的c DNA全长序列(Gen Bank No.:KP056747)。其全长为2 144 bp,含有一个1 671 bp的开放式阅读框(ORF),编码556个氨基酸序列,预测氨基酸大小为63.47 k D,等电点为7.71。蛋白质同源序列分析表明,Gb F3’H与其他物种F3’H同源性较低,而与菊苣(Cichorium intybus)同源性最高,为56.3%。同源建模分析显示Gb F3’H与P450家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似,最终定位于微粒体膜上。进化树分析结果显示Gb F3’H与其他植物分化较早,序列差异较大。组织表达分析显示,Gb F3’H在银杏不同组织中都有表达,其中雄蕊表达水平最高,其次为成熟叶。诱导表达分析显示,Gb F3’H转录水平受UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA影响诱导上调,而伤害处理对其表达量无明显影响。Gb F3’H诱导表达模式与调控银杏黄酮含量变化呈正相关,其上游调控序列存在与黄酮调控相关的顺式元件,意味着Gb F3’H可能参与了银杏黄酮类物质的合成代谢,并与黄酮类物质向花青素合成分流有关。

类黄酮3',5'羟基化酶基因的克隆及转化铁炮百合

利用RT-PCR技术从矮牵牛的紫色花瓣中克隆了两个控制花色的类黄酮3,5羟基化酶基因Hf1和Hf2,并构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法对铁炮百合进行了遗传转化,获得了转基因植株。

石榴花类黄酮3′羟化酶基因的克隆及序列分析

为研究花色苷生物合成途径中类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)的序列信息,以泰山红石榴花瓣为试材,提取总RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中登录的相关物种F3′H基因的保守序列设计兼并引物,对反转录后的cDNA进行PCR扩增并测序。结果表明:在石榴中克隆到了长度为996bp的F3′H基因cDNA片段,该基因编码331个氨基酸,含有细胞色素P450保守域,属于CYP75B亚家族。该序列在GenBank中的登录号为KC430328。

滁菊类黄酮3′-羟化酶基因的克隆及分子特性

以安徽滁州地区特有的药食两用植物资源——滁菊(Dendranthema morifolium‘chuju’)为试材,采用同源基因克隆方法克隆滁菊类黄酮3′-羟化酶基因(flavonoid 3′-hydroxylase,f3′h),NCBI注册号HQ256697。结果表明:采自不同地点的滁菊样品均能扩增出一条长381bp的f3′h基因片段,该片段与探针序列GU249553第3外显子对应区域的核苷酸序列同源性达98.69%,同源区域内有5个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNP),其中3个SNPs导致氨基酸编码序列的改变。滁菊与葡萄属(Vitis vinifera)、高粱属(Sorghum bicolor)、芸苔属(Brassica napus)、牵牛属(Ipomoea nil Magenta)、苹果属(Malus×domestica)、番薯属(Ipomoea purpurea)等物种f3′h基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在60%～98%和68%～97%之间。不同植物f3′h基因的分类与物种间的亲缘关系存在明显的相关性,菊属植物f3′h基因在系统进化中处于较高位置。

蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3＇5＇-羟化酶基因3＇末端的克隆和表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.×Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C.Wang)发育种子中克隆到两个查尔酮合酶基因(TaCHS.tl，TaCHS．wl)，分别编码394个氨基酸，二者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96．0％和98．9％；而且克隆到一个类黄酮3'5’．羟化酶基因(F3'5'H)3’-末端。分别从长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Podp．)Z．W．Liu et R．R．-C．Wang)、蓝粒小麦、白粒小麦和中国春基因组中分离到查尔酮合酶基因(CHS)的全长序列(ThpCHS.tg TaCHS．wg，TaCHS．csg)，它们的核苷酸序列之间具有很高的同源性，且均含有一个内含子(intron)，序列差异主要在内含子。通过DNA序列比较，发现一个CHS与亲本之一的长穗偃麦草基因组同源性达100％，一个CHS与另一白粒亲本基因组同源性达99％，表明来自于父、母本的CHS在蓝粒发育的种子中均表达。Southerm杂交结果表明CHS在小麦中的拷贝数至少有4个，不同颜色的蓝粒小麦、白粒小麦间拷贝数基本一致，但都与长穗偃麦草有差异，根据以上结果初步判定CHS在蓝粒小麦中属于一个多基因家族。Reverse Northern分析表明CHS在开花后15d发育的蓝粒小麦中具有较强的表达；花后21d F3'5'H和DFR的转录本积累显著高于CHS，基本上检测不到CHS的表达。这三个基因在蓝粒小麦中的表达顺序与其他植物花青素合成途径中的基因表达次序一致：ChS先于F3'5'H，F3'5'H先于DFR。实验还表明F3'5'H和DPR在幼叶中表达也较强，CHS仅在发育种子中表达，具有组织特异性。花后21d，F3’5’H在白粒、蓝粒小麦和中国春种子中均强烈表达，蓝粒小麦CHS和DFR转录本比白粒小麦多。因此，认为在蓝粒小麦中存在花青素生物合成途径，在蓝色色素形成过程中，该途径中的结构基因受到调节基因的调控。

茶树类黄酮3′-羟化酶基因的克隆与表达特性分析

类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)是细胞色素P450酶家族(Cytochrome P450,CYP450)的单加氧酶,在植物次生代谢和逆境调控方面起着重要的作用。本实验以茶树品种龙井43作为试验材料,利用RT-PCR方法,从c DNA中克隆得到茶树中编码类黄酮3′-羟化酶基因,命名为Cs F3′H1。序列分析显示,Cs F3′H1基因开放阅读框为1 530 bp,编码509个氨基酸,含有相对保守的P450酶系结合域。进化树分析表明,Cs F3′H1与Cs F3′H3的进化树关系相近,与Cs F3′H2的进化树关系较远。序列多重比对显示,Cs F3′H1蛋白具有F3′H蛋白的特征基序,并与高粱、猕猴桃、杨树、拟南芥和葡萄同源蛋白一致性为66.48%。氨基酸组分、理化性质、亲水性/疏水性和无序化分析显示,Cs F3′H1是亲水性蛋白,无序化特征不明显。利用实时荧光定量PCR对Cs F3′H1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,Cs F3′H1基因的表达水平在第一叶中最高,之后随着叶片的成熟逐渐下降,Cs F3′H1基因在老叶和根中几乎不表达,表达水平从高到低依次为第一叶>第二叶>第三叶>第四叶>嫩茎>根>老叶;在不同激素处理中,Cs F3′H1在SA激素处理下的表达量最高,为对照的2.24倍,在Me JA处理下表达量最低,为对照的0.43倍。

紫茎泽兰类黄酮3′-羟化酶在烟草中的表达

【目的】研究紫茎泽兰F3′H在次生代谢途径中的功能。【方法】构建了F3′H过表达载体,并将其转入烟草体内,进一步通过半定量RT-PCR和Real-timePCR检测F3′H的表达情况。【结果】F3′H在烟草体内能正常表达,但在开花后则受到抑制,表现为转F3′H烟草花色较野生型变淡,F3′H表达量低于野生型表达量。【结论】F3′H与次生代谢途径中花色素的形成密切相关,且转入烟草体内时,其表达与烟草内源基因表达相互影响,导致烟草的花色变淡。

中国水仙类黄酮3-氧-葡糖基转移酶基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙上分离克隆得到1个葡糖基转移酶基因,命名为Nt3GT,其cDNA全长1 682bp,包含有1个1 461bp完整阅读框架(ORF),编码487个氨基酸,具有Glycos_tranf_1superfamily蛋白保守区。系统进化分析表明,中国水仙与马铃薯属的3GT亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,Nt3GT在叶片和花中均有表达,各个时期的叶片中表达量稳定,但花中的表达量不稳定,在抽葶期花苞未检测到表达,在盛花期的表达最高。

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486 kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT(P51094.2)的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。

紫茎泽兰类黄酮3′-羟化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

用基因特异引物对紫茎泽兰F3'H基因进行PCR扩增、T-A克隆及测序,采用DNAMAN 5.0和MEGA 3.0等生物信息学软件进行序列分析,并对F3'H基因的组织表达特性及原核表达产物进行了分析。结果表明紫茎泽兰F3'H基因cDNA全长为1722 bp(GeneBank登录号EF137714),编码570个氨基酸,与翠菊、大豆和非洲菊F3'H基因的氨基酸序列同源性分别为64.4%,57.3%和54.5%。Southe(?)杂交表明该基因为单拷贝。Northe(?)杂交表明F3'H基因在紫茎泽兰叶中表达量最高,且其表达受泽兰酮诱导。SDS-PAGE电泳表明F3'H基因经IPTG诱导后在大肠杆菌中能表达56.8 kDa的目的蛋白。

三种花色黄芩中F3′5′H基因的克隆及表达分析

类黄酮3′,5′-羟化酶(flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是花青素合成途径中催化形成蓝色飞燕草素的关键酶。本研究通过RT-PCR方法,从蓝紫花、玫红花、白花黄芩中克隆得到F3′5′H基因的全长序列,分别命名为SbF3′5′H-b、SbF3′5′H-r、SbF3′5′H-w。经序列比对,SbF3′5′H-r基因较SbF3′5′H-b/w缺失7 bp,导致蛋白翻译提前终止。生物信息学分析显示,三个SbF3′5′H蛋白均属于细胞色素P450家族,定位在内质网。SbF3′5′H-B/W蛋白具有典型的CYP450保守序列,包括富含脯氨酸基序“LPPGP”、底物识别位点SRS1~6、折叠锁定基序“E××R”、血红素结合基序“PFGAGRRICAG”及预测的羟化活性位点CR1和CR2。而SbF3′5′H-R蛋白由于序列缺失影响二级、三级结构,并导致CYP450结构域不完整,C端缺少多个维持酶活性的保守基序。基于F3′5′H蛋白序列的系统进化分析结果显示,黄芩与同为唇形科的丹参、一串红等亲缘关系最近,聚在一个分支,与单子叶植物亲缘关系较远。基因表达分析结果显示,SbF3′5′H在白花中整体表达最高,其次是蓝紫花,玫红花中整体表达最低;不同花发育阶段比较,SbF3′5′H基因均呈现出先升高后降低的趋势,在中蕾期表达量最高,其次是幼蕾期,盛花期表达量最低,蓝紫和白花黄芩不同花发育阶段间差异显著或极显著。本研究结果可为进一步研究不同花色黄芩中SbF3′5′H基因的功能差异、揭示黄芩花色变异的分子机理奠定理论基础。