茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。

植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展

植物类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)属转移酶类的甲基转移酶家族,是一类可催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)中的-CH3基团转移到类黄酮-OH上的蛋白质酶。甲基化是类黄酮物质最基本、最主要的修饰反应之一,不仅可以降低类黄酮的化学反应活性,而且增加了其脂溶性,赋予了类黄酮更多的生理生化特性。该文对近年来国内外有关类黄酮甲基化对植物中FOMT催化的生理生化代谢反应、FOMT的分类、FOMT酶蛋白结构域、生物学功能以及FOMT基因克隆与表达调控等方面的研究进展进行综述,为植物类黄酮更广泛、更深入的研究提供新的思路与途径。

银杏类黄酮O-甲基转移酶活性的高效液相色谱分析

首次明确了银杏叶片类黄酮生物代谢关键酶O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)活性的HPLC测定技术与方法。采集扬州大学银杏种质资源圃银杏雄株成熟叶片,提取粗酶液,根据FOMT催化反应生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的原理,以山奈酚、槲皮素和异鼠李素等3种黄酮苷元为反应底物,采用优化的HPLC体系检测样品中FOMT催化反应生成的SAH峰面积,通过标准曲线求得不同反应底物的FOMT相对活性。FOMT活性反应生成物SAH在1.5～20μg/mL内呈良好的线性关系,RSD为2.1%(n=5),建立了FOMT活性测定优化体系。不同反应底物的FOMT活性表现不同,山奈酚与异鼠李素显著高于槲皮素。FOMT活性HPLC测定方法准确、快速、可靠、灵敏度高。

大肠杆菌表达类黄酮O-甲基转移酶合成槲皮素甲基化衍生物

槲皮素是一种重要的柑橘类黄酮,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生物学活性,但水溶性和脂溶性较差,研究表明可通过甲基化提高其代谢稳定性和生物利用度,目前微生物转化法是获得甲基化槲皮素的良好方法。作者筛选了11种不同来源的类黄酮O-甲基转移酶(FOMT),并根据甲基化位点进行分类构建相应的大肠杆菌工程菌,以槲皮素为底物进行发酵分别合成了4种单O-甲基槲皮素(柽柳黄素、鼠李素、异鼠李素和3-O-甲基槲皮素),最高产量分别为31.17、11.17、8.90、52.95 mg/L。随后构建了大肠杆菌共培养体系,分步添加含有MpOMT4和OsNOMT的重组大肠杆菌全细胞催化剂,并通过调整体系中两种菌体的比例和生物量,最终确定菌体细胞质量浓度为24 g/L(以细胞干质量计)、两种菌体质量比为1∶2时,4′,7-二甲氧基槲皮素的最高产量为21.56 mg/L。

艾叶类黄酮O-甲基转移酶基因家族的鉴定及表达分析

艾(Artemisia argyi)以叶片入药,为我国常用大宗中药材,主要活性成分为挥发油、黄酮等化合物,具有多种药理活性。目前鉴定到的艾叶黄酮类物质多为氧甲基化修饰,而类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物氧甲基化修饰的关键酶。为进一步了解FOMT蛋白功能及特性,本研究对艾中FOMT基因家族进行了全基因组的挖掘和鉴定,并进行系统发育、染色体定位、基因序列特征、亚细胞定位预测、蛋白结构、基因结构分析及表达模式的分析和验证。结果表明,在艾的基因组中,共鉴定得到83个FOMT基因,系统发育树显示FOMT基因分为CCoAOMT(caffeoyl CoA O-methyltransferase)亚家族(32个基因)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)亚家族(51个基因)两个亚类。基因序列特征分析显示FOMT编码氨基酸的数目介于70~734 aa,分子质量为25296.55~34241.3 Da,等电点为4.51~9.99,与32个CCoAOMT亚家族成员相比,51个COMT亚家族成员中,约1/3的FOMT蛋白为疏水性蛋白,2/3蛋白为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示超过80%的CCoAOMT亚家族成员定位于细胞质,96%的COMT亚家族成员定位于叶绿体。COMT成员相对CCoAOMT成员motif数较多,且位于N端的motifs变异相对较大,位于C端的motifs相对保守;表达模式分析显示CCoAOMT亚家族成员主要在根中表达,而COMT成员主要在叶片中高量表达;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了部分FOMT在叶片中优势表达,具有组织表达特异性。本研究对艾叶FOMT基因家族进行鉴定与分析,为进一步深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

植物甲基化类黄酮及其O-甲基转移酶研究进展

植物类黄酮是重要的药用成分,其生物学功能与化学结构密切相关。O-甲基化修饰可提高类黄酮的稳定性、蛋白亲和力和生物利用度,从而增强其药用活性。O-甲基转移酶(O-methyltransferase)催化类黄酮合成O-甲基化衍生物,是类黄酮代谢途径中的关键修饰酶。本文综述了植物O-甲基化类黄酮的化学结构、药用功能及其药用价值提高机理;并对植物类黄酮O-甲基转移酶的生物学功能、表达调控与开发潜力等进行了总结展望,以期为植物甲基化类黄酮的进一步研究提供新的思路与途径。

头花蓼黄酮类化合物O-甲基转移酶基因家族的鉴定及表达分析

头花蓼Polygonum capitatum为贵州特色苗药,临床常用于治疗胃肠道和泌尿系统感染,研究发现其具有较好的抑菌抗炎作用,其主要活性成分为黄酮类化合物。黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物氧甲基化修饰的关键酶,为了解头花蓼FOMT蛋白功能及特性,本研究以头花蓼根、茎、叶、花为材料,采用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术进行转录组测序,对获得的转录本进行注释分析,并对头花蓼中FOMT基因家族进行全基因组的挖掘和鉴定。共获得99 298条Unigenes,其中71 514条被公共数据库成功注释。头花蓼的基因组中,共鉴定得到50个FOMT基因,系统发育树显示FOMT基因分为咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶(caffeoyl CoA O-methyltransferase,CCoAOMT)亚家族和咖啡酸O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)亚家族两个亚类。基因序列特征分析显示FOMT编码氨基酸的数目介于99~1053aa,分子质量为11 224.91~86 687.42 Da,等电点为4.79~9.45,50个FOMT家族成员均为疏水性蛋白,亚细胞定位结果显示54%的FOMT亚家族CCoAOMT及COMT成员定位于细胞质,28%定位于叶绿体。FOMT基因具有组织特异性,在头花蓼花中高表达,其次是茎,在根中表达最低。本研究对头花蓼FOMT基因家族进行鉴定与分析,为进一步深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

苦荞类黄酮糖基转移酶FtUFGT1的重组表达与酶学性质分析

黄酮类化合物是苦荞重要的功能性成分,其糖基化修饰可改变生物体内黄酮类化合物的稳定性、可溶性及生物活性。该研究基于苦荞转录组数据并以苦荞叶片中提取的总RNA为材料,利用RT-PCR克隆了苦荞类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose:flavonoidglycosyltransferase,UFGT)基因FtUFGT1,采用无缝克隆方式构建其重组表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态,采用GST-resin纯化重组表达的蛋白,采用高效液相色谱(HPLC)技术检测分析纯化后FtUFGT1的酶学性质。结果表明:(1)成功克隆的FtUFGT1编码区为1413 bp,其编码470个氨基酸,并成功构建了FtUFGT1的重组表达载体pGEX-6p-1-FtUFGT1。(2)经转化苦荞FtUFGT1基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到可溶性的表达,并通过GST亲和层析纯化得到高纯度的苦荞FtUFGT1蛋白。(3)HPLC分析显示,以槲皮素为底物,苦荞FtUFGT1可催化异槲皮素的合成,比活力为9.174 U/mg;重组FtUFGT1的最适温度为30℃,最适pH为7.0,5%(V/V)的甲醇和0.5%(V/V)的Triton X-100可以显著抑制其活性。研究结果为深入揭示FtUFGT1的生物学功能及体外催化黄酮类衍生物的合成奠定了基础。

河谷地不容3个O-甲基转移酶原核表达及生物信息学相关分析

目的:为了研究河谷地不容中苄基异喹啉类生物碱生物合成途径的功能基因,从河谷地不容中克隆3个O-甲基转移酶基因,进行生物信息学及原核表达分析。方法:以河谷地不容为材料,采用PCR方法克隆出3个O-甲基转移酶(Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2)基因并采用在线工具进行生物信息学分析;采用同源重组技术将3个基因分别构建至原核表达载体进行蛋白表达。结果:同源性和基本理化性质分析结果显示,Si4′OMT形成独立的进化分支,Si6OMT1与来自于Stephania tetrandra S.Moore的St6OMT2聚类成同一个进化分支,Si6OMT2与来源于S.tetrandra的St6OMT4聚类成同一个进化分支;3个O-甲基转移酶中Si6OMT1相对于Si4′OMT和Si6OMT2更稳定。Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2在大肠杆菌中均能形成可溶性表达。结论:成功从河谷地不容中克隆出3个O-甲基转移酶基因,并且在大肠杆菌原核表达系统中能实现可溶性表达,为解析河谷地不容中苄基异喹啉类生物碱的生物合成途径及途径中的关键酶积累一定的科学数据。

3种方法提取洋葱中的类黄酮物质对肝癌细胞株HepG2的作用

目的研究3种方法提取洋葱中的类黄酮物质对肝癌细胞株HepG2的作用。方法采用水煎煮法、50%乙醇回流法及50%乙醇冷浸法从洋葱中提取类黄酮物质,将其分别加入处于对数生长期的HepG2肝癌细胞中培养,以PBS为对照组,20、30、40、50、70μg.ml-1的类黄酮物质为实验组,用MTT法分别测定给药前及给药72 h后各浓度组在490 nm处的吸光度。结果水煎煮法、50%乙醇回流法及50%乙醇冷浸法提取的类黄酮物质抑制HepG2肝癌细胞生长的起始浓度分别为40、50、40μg.ml-1,随着浓度的增加,抑制作用显著增强。结论洋葱中类黄酮物质对体外培养的HepG2肝癌细胞表现出明显的抗肿瘤活性,50%乙醇冷浸法所提类黄酮物质的抗肿瘤活性最强。

荔枝果皮中4种酚类代谢酶活性的测定方法

为了改进酚类物质生物合成途径中关键酶酶活性的测定方法,以南方重要常绿果树荔枝Litchi chinensis果皮为材料,采用两点法和酶动力法2种酶活性研究方法,结合分光光度法和高效液相色谱法检测产物浓度变化,优化了4种酚类代谢常见酶[包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查儿酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)]的测定方法,指出了酶液的纯化、酶活性的保护以及反应底物的溶解方法等对试验结果的稳定性和可靠性的影响,介绍了试验过程中常遇到的问题和具体的解决方法以及试验过程中的注意事项.应用改进后的方法测定荔枝发育过程中果皮PAL、CHI、DFR和UFGT的酶活性,结果发现活性变化趋势与前人的报道基本一致.改进的PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性的测定方法可靠,可为相关的研究提供重要的参考.

芳香族异戊烯转移酶的研究进展

异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移至异戊烯单元、芳香环或蛋白质上。芳香族异戊烯基转移酶将异戊烯单元融入含有芳环的化合物,从而形成具有重要生物学功能的各类活性分子,如泛醌、质体醌、维生素E、异戊烯黄酮类以及真菌代谢物等。该文综述了近年来植物和真菌芳香族异戊烯转移酶的分子生物学研究进展,包括膜结合的参与质体醌生物合成的homogentisate solanesyltransferase、参与维生素E生物合成的homogentisate phytyltransferase、类黄酮异戊烯转移酶(flavonoid prenyltransferase)和可溶性的真菌吲哚异戊烯转移酶等。

苦荞麦总黄酮对胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞ADMA/PRMTⅠ/eNOS/NO的影响

目的研究苦荞麦总黄酮对胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞内NO、不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethyl arginine,ADMA)的合成及相关基因PRMTⅠ、e NOS表达的影响。方法将培养的EA.hy926细胞分为正常对照组、模型组、苦荞麦总黄酮组及二甲双胍组。采用硝酸还原酶法测定细胞培养基中NO的含量;采用双抗体夹心法测定细胞中ADMA的含量,采用RT-PCR以及免疫印迹(western blot)法分别测定各组细胞e NOS及PRMTⅠmRNA和蛋白的表达。结果同正常组相比,模型组细胞培养基中NO含量明显降低(P<0.01),细胞中ADMA含量显著升高(P<0.01),e NOS mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01),PRMTⅠmRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.01);同模型组相比,苦荞麦总黄酮组及二甲双胍组以上指标均有明显改善,两组之间无明显差异。结论苦荞麦总黄酮通过降低胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞PRMTⅠmRNA及蛋白的表达,降低细胞中ADMA的含量,提高eNOS mRNA及蛋白表达,使NO合成增多,改善胰岛素抵抗。

植物类黄酮转运与积累机制的研究进展

类黄酮是植物次生代谢过程中产生的多酚类物质,在植物中广泛存在且功能多样。类黄酮的生物合成发生在内质网的细胞质侧,但最终积累在液泡腔内。因此,需要高效的类黄酮转运和积累系统将其从内质网转移至液泡内。几十年来,关于植物类黄酮转运有诸多研究。目前的研究结果表明,植物体内存在3种类黄酮转运机制,包括谷胱甘肽转移酶介导的转运及膜转运蛋白和囊泡介导的转运。该文综述了这3种转运机制以及近年来植物类黄酮转运研究进展,分析总结了3种不同但具有非排它性机制在功能上的协同作用。虽然类黄酮生物合成途径在许多物种中得到很好的表征,但是关于其转运研究仍相对缺乏。类黄酮修饰与转运的关系、转运蛋白对底物的特异性和偏好性及类黄酮转运的转录调控仍需深入探索,以更好地解析类黄酮在植物细胞中的转运和积累机制。

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。

植物谷胱甘肽转移酶在类黄酮累积中的作用

植物谷胱甘肽转移酶(GSTs)是一类广泛存在于植物中的多功能蛋白,参与调节植物次生代谢、解毒和防御等。深入研究GSTs在类黄酮累积中的作用,对于揭示植物类黄酮累积的调控机制具有重要意义。本文主要从GSTs的分类出发,对近年来不同类别GSTs在类黄酮累积中的作用进行了综述。

粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与表达分析

药用植物淫羊藿富含异戊烯类黄酮,LC-MS定量分析表明,3～4月份粗毛淫羊藿叶片处于变色期时淫羊藿苷含量最高。通过简并引物和RACE-PCR从粗毛淫羊藿叶片获得异戊烯转移酶同源基因(命名为EaPT1)。序列分析表明,EaPT1与维生素E合成相关的尿黑酸异戊烯转移酶位于同一进化枝,靠近类黄酮异戊烯转移酶。RT-PCR结果显示,EaPT1在叶片和幼茎中表达显著。

槭属2品种叶变色期花青苷含量与相关酶活性的变化

以自由人槭‘秋天火焰’和红花槭‘白兰地’为试材,研究槭属品种变色过程中(10月12日—11月19日),叶片花青苷含量及其生物合成相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查儿酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)的活性变化。结果表明:2个品种叶片中花青苷含量随叶色的变化为单峰曲线,分别在第20和25天出现峰值;PAL,DFR和UFGT酶活性与花青苷含量均成2次曲线关系,CHI酶活性与花青苷含量呈极显著的线性关系;PAL,CHI和UFGT是‘秋天火焰’花青苷合成的关键酶,CHI和UFGT是‘白兰地’花青苷合成的关键酶。

精神分裂症患者儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因单核苷酸多态位点与利培酮疗效的关联研究

目的分析利培酮治疗首次发病（以下简称首发）的精神分裂症患者疗效与儿茶酚胺氧位甲基转移酶（COMT）基因多态性的关联，探讨利培酮疗效的敏感基因。方法对203例首发精神分裂症患者给予利培酮治疗8周（2—8mg／d），分别于治疗前和治疗第2—8周末采用阳性和阴性症状量表（PANSS）评分，以减分率评定疗效。并采用限制性片段长度多态技术和序列特异性引物聚合酶链反应技术测定基因型。对痊愈组（29例）、进步组（153例）及无效组（21例）精神分裂症患者与COMT基因单核苷酸多态位点（SNPs）进行关联分析。结果COMT基因3种多态性基因型及基因频率在利培酮不同疗效患者组间分布差异均无统计学意义（P均〉0．05）。COMT的3个单核苷酸多态位点单体型分析，利培酮治疗痊愈组与进步组、有效组与无效组间的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论COMT基因可能不是首发精神分裂症患者抗精神病药利培酮的疗效敏感基因。