银杏类黄酮O-甲基转移酶活性的高效液相色谱分析

首次明确了银杏叶片类黄酮生物代谢关键酶O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)活性的HPLC测定技术与方法。采集扬州大学银杏种质资源圃银杏雄株成熟叶片,提取粗酶液,根据FOMT催化反应生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的原理,以山奈酚、槲皮素和异鼠李素等3种黄酮苷元为反应底物,采用优化的HPLC体系检测样品中FOMT催化反应生成的SAH峰面积,通过标准曲线求得不同反应底物的FOMT相对活性。FOMT活性反应生成物SAH在1.5～20μg/mL内呈良好的线性关系,RSD为2.1%(n=5),建立了FOMT活性测定优化体系。不同反应底物的FOMT活性表现不同,山奈酚与异鼠李素显著高于槲皮素。FOMT活性HPLC测定方法准确、快速、可靠、灵敏度高。

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。

植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展

植物类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)属转移酶类的甲基转移酶家族,是一类可催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)中的-CH3基团转移到类黄酮-OH上的蛋白质酶。甲基化是类黄酮物质最基本、最主要的修饰反应之一,不仅可以降低类黄酮的化学反应活性,而且增加了其脂溶性,赋予了类黄酮更多的生理生化特性。该文对近年来国内外有关类黄酮甲基化对植物中FOMT催化的生理生化代谢反应、FOMT的分类、FOMT酶蛋白结构域、生物学功能以及FOMT基因克隆与表达调控等方面的研究进展进行综述,为植物类黄酮更广泛、更深入的研究提供新的思路与途径。

植物甲基化类黄酮及其O-甲基转移酶研究进展

植物类黄酮是重要的药用成分,其生物学功能与化学结构密切相关。O-甲基化修饰可提高类黄酮的稳定性、蛋白亲和力和生物利用度,从而增强其药用活性。O-甲基转移酶(O-methyltransferase)催化类黄酮合成O-甲基化衍生物,是类黄酮代谢途径中的关键修饰酶。本文综述了植物O-甲基化类黄酮的化学结构、药用功能及其药用价值提高机理;并对植物类黄酮O-甲基转移酶的生物学功能、表达调控与开发潜力等进行了总结展望,以期为植物甲基化类黄酮的进一步研究提供新的思路与途径。

大肠杆菌表达类黄酮O-甲基转移酶合成槲皮素甲基化衍生物

槲皮素是一种重要的柑橘类黄酮,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生物学活性,但水溶性和脂溶性较差,研究表明可通过甲基化提高其代谢稳定性和生物利用度,目前微生物转化法是获得甲基化槲皮素的良好方法。作者筛选了11种不同来源的类黄酮O-甲基转移酶(FOMT),并根据甲基化位点进行分类构建相应的大肠杆菌工程菌,以槲皮素为底物进行发酵分别合成了4种单O-甲基槲皮素(柽柳黄素、鼠李素、异鼠李素和3-O-甲基槲皮素),最高产量分别为31.17、11.17、8.90、52.95 mg/L。随后构建了大肠杆菌共培养体系,分步添加含有MpOMT4和OsNOMT的重组大肠杆菌全细胞催化剂,并通过调整体系中两种菌体的比例和生物量,最终确定菌体细胞质量浓度为24 g/L(以细胞干质量计)、两种菌体质量比为1∶2时,4′,7-二甲氧基槲皮素的最高产量为21.56 mg/L。

艾叶类黄酮O-甲基转移酶基因家族的鉴定及表达分析

艾(Artemisia argyi)以叶片入药,为我国常用大宗中药材,主要活性成分为挥发油、黄酮等化合物,具有多种药理活性。目前鉴定到的艾叶黄酮类物质多为氧甲基化修饰,而类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物氧甲基化修饰的关键酶。为进一步了解FOMT蛋白功能及特性,本研究对艾中FOMT基因家族进行了全基因组的挖掘和鉴定,并进行系统发育、染色体定位、基因序列特征、亚细胞定位预测、蛋白结构、基因结构分析及表达模式的分析和验证。结果表明,在艾的基因组中,共鉴定得到83个FOMT基因,系统发育树显示FOMT基因分为CCoAOMT(caffeoyl CoA O-methyltransferase)亚家族(32个基因)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)亚家族(51个基因)两个亚类。基因序列特征分析显示FOMT编码氨基酸的数目介于70~734 aa,分子质量为25296.55~34241.3 Da,等电点为4.51~9.99,与32个CCoAOMT亚家族成员相比,51个COMT亚家族成员中,约1/3的FOMT蛋白为疏水性蛋白,2/3蛋白为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示超过80%的CCoAOMT亚家族成员定位于细胞质,96%的COMT亚家族成员定位于叶绿体。COMT成员相对CCoAOMT成员motif数较多,且位于N端的motifs变异相对较大,位于C端的motifs相对保守;表达模式分析显示CCoAOMT亚家族成员主要在根中表达,而COMT成员主要在叶片中高量表达;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了部分FOMT在叶片中优势表达,具有组织表达特异性。本研究对艾叶FOMT基因家族进行鉴定与分析,为进一步深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

青稞OMT1基因克隆及原核表达分析

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)是一种在植物甲基化黄酮代谢合成中有着重要作用的酶,但在中国青藏高原的特色作物青稞中研究较少。为了更好了解该酶及编码基因在青稞中的生理功能及作用,以高总黄酮青稞品系94-19-1为材料,通过RT-PCR扩增、克隆得到青稞OMT1基因的ORF序列。结果表明,该基因ORF长1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量为38.65 KDa,等电点为5.33。序列比对分析发现,所克隆的基因与NCBI数据库收录的大麦Hv OMT1基因有99.44%的一致性,氨基酸序列存在5个残基差异,编码的蛋白序列具有OMT蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体转化大肠杆菌,最终成功将该基因所编码的蛋白在大肠杆菌诱导表达,并利用亲和层析柱分离技术,将该表达蛋白进行了纯化。这为进一步研究该酶蛋白功能和选育高品质青稞品种奠定了基础。