类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染THP-1细胞模型的评价及其感染机制的初步探讨

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei,BP for short)感染人急性单核白血病细胞THP-1的细胞模型,探讨聚乙二醇3350(PEG 3350)对细菌侵入细胞及胞内生存的影响,对比类鼻疽伯克霍尔德氏菌与其减毒株(也称为泰国株,即Burkholderia thailandensis,B.thailandensis,BT for short)的感染特性。方法通过绘制细菌生长曲线,探讨类鼻疽伯克霍尔德氏菌及其减毒株的增殖规律;通过透射电镜观察细菌胞内感染状态和宿主细胞的超微病理变化;分析不同时相的细菌入胞率和胞内生存状态,探讨细菌与宿主细胞的相互作用;通过检测受感染细胞培养液的上清和患者血清中的细胞因子,评价宿主细胞的反应性和PEG对于细菌侵入细胞及胞内生存的影响,以及对比细胞受类鼻疽伯克霍尔德氏菌及其减毒株感染后的炎症反应性,从而评价该模型的稳定性。结果确定了B.pseudomallei和B.thailandensis的生长规律和感染时相特征及超微病理损伤特点。炎症因子测定中,两种细菌感染细胞后分泌的TNF-α出现感染中期的高峰,受BP感染的细胞的IL-6分泌则呈双峰改变,受BT感染的细胞IL-6的分泌和PEG对细胞分泌炎症因子的影响更为复杂。同时,患者血清中细胞因子的检测则没有显示出一定的规律,与其临床转归关系也不明确。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染THP-1细胞的模型,初步探讨了类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染宿主细胞的机制。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染RAW264.7细胞模型的建立

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法摸索类鼻疽伯克霍尔德氏菌培养条件、构建模型的感染条件(e.g.感染复数,感染时间),通过吉姆萨染色、透射电镜、活细胞工作站动态观察等确证胞内感染和宿主细胞的形态变化,分析病原菌侵袭率、胞内复制率和宿主反应性来评价该模型中病原菌侵入RAW264.7特点和病理损伤类型。结果确定了类鼻疽伯克霍尔德氏菌的一般培养条件,感染复数MOI=100感染宿主细胞,170g离心5min后37℃共孵1h以利于细菌侵入胞内,含250μg/ml卡那霉素的DMEM-10培养以杀死胞外病原菌。形态观察,类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染后最早8h可观察到异物多核巨细胞(MNGC),RAW264.7细胞伸出伪足,相互融合。感染初期(<3h)TNF-α升高较快,9h后则下降至低值,直至感染后期(15～24h)再次升高。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌胞内感染模型,拟为进一步研究其致病机制提供了条件。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌UDPE检测方法的建立和应用

目的 建立防止产物污染的UDPE(UDG -DuplexPCR -EIA)技术 ,用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法 选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR(FerricUptakeRegulator)基因为靶序列 ,设计两对引物进行PCR扩增 ,用UDG(尿嘧啶糖基化酶 )防止PCR产物污染 ,并用微孔板杂交 -酶联显色检测扩增的PCR产物片段 ;用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果 该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌 ;对于纯DNA模板 ,检测灵敏度可以达到 10fg/ μl;对于系列稀释菌液提取的模板 ,灵敏度可达 0 1个菌 / μl;对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为 10个菌 / μl,10 0个菌 / μl和 10 0个菌 / μl;检测系统可以防止 10 9个PCR产物分子的污染 ;检测系统可以在 37℃下稳定保存 7d。结论 本研究建立了稳定的 ,防止产物污染 。

死亡海豚中分离到类鼻疽伯克霍尔德氏菌

目的分离鉴定致海豚死亡的致病菌。方法用常规的检验方法对送检标本进行分离培养及鉴定,包括形态学、培养特性、生化特征和血清学试验的研究。结果海豚各种组织所分离的细菌其形态学、培养特性、生化特征和血清学试验均符合类鼻疽伯克霍尔德氏菌,药敏试验对亚胺培南、头孢他啶、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦均为敏感。结论海南海洋馆海豚的死亡为类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染所致。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染A549细胞模型的建立

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染人肺癌上皮细胞A549的细胞模型。方法优化类鼻疽伯克霍尔德杆菌感染A549细胞的感染条件(如MOI、感染时间),通过活细胞工作站动态观察、Giemsa染色、激光共聚焦、透射电镜确证胞内感染和宿主细胞的形态变化,通过炎症因子IL-8和TNF-α的检测,分析病原菌入胞率和宿主反应性,评价该模型中病原菌侵入A549导致多核巨细胞(multinuclear giant cell,MNGC)形成的特点和病理损伤规律。结果透射电镜结果显示类鼻疽伯克霍尔德氏菌侵入到胞内的时间最早是4 h。通过Giemsa染色形态观察,类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染后最早8 h可观察到典型MNGC的形成。随着感染时间的延长,MNGC形成率和炎症因子IL-8逐渐升高,而TNF-α在此模型中变化不明显。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染A549细胞模型。

广西地区类鼻疽伯克霍尔德氏菌的分布调查

目的调查类鼻疽伯克霍尔德氏菌在广西地区的详细分布情况。方法于2007年底对广西地区的14个地级市进行了大规模调查,共采集了77个地点的154个土壤样品和130个水样。采样通过细菌分离培养方法、16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的方法进行鉴定分析,对类鼻疽伯克霍尔德氏菌检出情况的地理分布进行绘图记录。结果 154份土壤样品中分离纯化出13株类鼻疽伯克霍尔德氏菌,阳性率为8.4%,没有在水样中发现该菌;分离纯化结果与16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的结果完全一致。分离纯化类鼻疽伯克霍尔德氏菌阳性的采样点分布在中东、南宁、钦州、放城、北海5个地区。结论广西地区的类鼻疽伯克霍尔德氏菌主要分布在北回归线以南,南海附近地区。

儿童结核感染合并类鼻疽伯克霍尔德氏菌脓毒症1例

目的分析儿童类鼻疽伯克霍尔德氏菌脓毒症合并结核感染的临床特点。方法回顾分析1例儿童类鼻疽伯克霍尔德氏菌脓毒症合并结核感染的临床资料。结果患儿,男,9岁,以发热、头痛、呕吐为临床表现,既往结核感染不规则治疗,血培养发现类鼻疽伯克霍尔德氏菌,亚胺培南西司他丁钠联合利福平、异烟肼抗感染治疗有效,随访至今无复发。结论类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染临床特点复杂多样,常规抗生素治疗效果欠佳,在儿童感染中少见,儿科医生应充分重视,早诊断,早治疗。

糖尿病足合并类鼻疽伯克霍尔德菌感染64例临床特征、药敏特点和治疗分析

目的 总结糖尿病足(DF)合并类鼻疽伯克霍尔德菌(BP)感染的临床特征、药敏特点和治疗方法。方法 回顾分析2012年1月至2022年3月海南医学院第二附属医院收治的64例DF合并BP感染病人的临床表现、微生物抗菌药物敏感性及治疗手段。结果 64例DF合并BP感染病人中,60例有发热症状、34例有白细胞升高、均有C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)升高、14例合并肝或脾脓肿、30例出现肝功能不全、20例出现肾功能不全、18例合并感染性休克。64株BP对大多数常见的抗生素敏感性较差,但均对亚胺培南、美罗培南和复方磺胺甲唑敏感。所有病人均使用胰岛素积极控制血糖,大多数静脉应用碳青霉素烯类抗菌素约6周,出院后继续使用复方磺胺甲唑治疗。最终22例治愈,30例好转,8例未愈,4例死亡。死亡病例均合并多器官功能障碍。结论 DF合并BP主要表现为发热、CRP和PCT明显升高、合并肝或脾脓肿和肝肾功能不全,易出现感染性休克。对高度怀疑BP感染病人应多次进行培养,并及早静脉应用碳青霉素烯类抗菌素可能有助于改善预后。

基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

假鼻疽伯克霍尔德菌感染1例

类鼻疽病是一种人畜共患传染病,由假鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,BP)感染引起,一般多见于热带和亚热带地区,在我国以海南省和广东省较为多见[1-2],其他地区偶见散发病例。类鼻疽可引起软组织感染、肝肺脓肿、脓毒血症、败血症等,也可见肌肉组织与骨骼感染并发症等[3];该病发病率低,但病死率高达30%[4]。由于其临床表现不典型,容易漏诊和误诊,我院收治1例由BP引起的手坏死性筋膜炎,明确病原学诊断后,对其不典型性表现报告如下。

类鼻疽伯克霍尔德菌致病及耐药机制

类鼻疽伯克霍尔德菌是导致类鼻疽的病原菌。类鼻疽慢性感染时间长,急性起病时临床表现不典型、易发生危及生命的并发症、预后不佳。研究病原菌类鼻疽伯克霍尔德菌的致病及耐药机制将有效帮助疾病的诊疗,改善预后。本文从类鼻疽伯克霍尔德菌在宿主细胞外运动的形式、感染宿主细胞的方式、毒力因子、耐药机制(外排泵、靶位点改变等)等方面阐述。为该菌所致类鼻疽的早期诊治及控制提供可能的方向。

1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性和杀菌能力评估

为探究类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性,本试验采用双层平板法分离筛选类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体;采用形态学、一步生长曲线、宿主范围测定分析该噬菌体的生物学特性;通过小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测评估该噬菌体的疗效。结果显示,成功分离出1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体,命名为HNS1。形态学观察显示,噬菌体头部为正二十面体,直径为(62.8±3.0)nm,尾部长为(54.9±5.0)nm,根据命名法则该噬菌体属于肌尾噬菌体。一步生长曲线测定结果显示,该噬菌体的潜伏期约为32 min,释放量约为8.04 PFU/infection center。宿主范围测定结果显示,该噬菌体的裂解率达到73.3%(11/15)。小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测结果显示,该噬菌体能够有效在小鼠体内和环境中裂解类鼻疽伯克霍尔德菌。结果表明,筛选得到的噬菌体具有较广的裂解谱,可能成为治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的潜在抗菌剂。

1株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉中的产毒规律分析

目的:了解防腐剂(脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐)和培养温度对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉培养基上生长及产毒的影响。方法:以1株自食物中毒事件样品中分离得到的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)菌株为研究对象,分别接种至添加脱氢乙酸(1.0 g/kg)、添加ε-聚赖氨酸盐酸盐(0.25 g/kg)以及未添加防腐剂的湿米粉培养基中,置于10,26,36℃条件下培养,研究其在湿米粉中生长及产毒情况。采用修正的Gompertz模型构建初级生长模型。结果:在10℃条件下该菌生长缓慢且未产生米酵菌酸;在26℃条件下培养至96 h,该菌对照组和各试验组产生的毒素均超过500μg/kg,在添加脱氢乙酸的样品中最早产生米酵菌酸,其最高质量浓度(1 484μg/kg)略低于对照组(2 561μg/kg)和ε-聚赖氨酸盐酸盐组(2 762μg/kg);在36℃条件下该菌生长最为快速,各组产毒量均低于350μg/kg。结论:湿米粉在10℃贮存可有效降低产生米酵菌酸的风险,脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐均未能阻止唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长和产毒,需进一步探索能起作用的防腐剂,制定多手段结合的控制措施。

类鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎1例并文献复习

类鼻疽病是一种需氧型革兰氏阴性杆菌类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病,具有多种临床表现,其中以类鼻疽伯克霍尔德菌性脓毒症最为严重。本文介绍了广东医科大学附属东莞第一医院1例以反复发热、咳嗽、咳痰为主要临床表现的患者,该患者上述症状反复,常规抗生素治疗无效,通过超声引导下肺门淋巴结穿刺术等检查考虑类鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎,予维护器官功能、亚胺培南等抗感染为主要治疗手段。患者无主诉不适出院,后期随访无再次发热等症状。结合治疗中的问题,本文回顾复习相关文献,对假鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎患者诊治经验进行报道。类鼻疽病临床诊断非常具有挑战性,容易误诊或漏诊。临床上碰到诊断不明确的相关感染性疾病,要及时考虑到类鼻疽伯克霍尔德菌感染可能,明确临床工作者对类鼻疽病早期诊断和治疗的重要性,避免误诊、漏诊。

吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产葡聚糖酶条件的优化

以吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为研究对象,优化其发酵产葡聚糖酶条件。首先,通过单因素实验对其培养条件(碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、转速、温度、装液量、接种量、初始pH值、表面活性剂种类、表面活性剂质量浓度和时间)进行初步优化,然后通过Plackett-Burman试验,筛选出4个显著影响B1213产葡聚糖酶的因素,再利用最陡爬坡试验确定其产葡聚糖酶的最大响应区域,最后通过Box-Behnken试验设计确定其最优产葡聚糖酶条件为:40~60目麦麸质量浓度50 g/L,酵母浸粉质量浓度8 g/L,初始pH 6.6,装液量30 mL/250 mL,接种量0.15%,曲拉通100质量浓度25 g/L,温度30℃,转速160 r/min和培养时间83 h。在此培养条件下B1213产葡聚糖酶活力达到1230 U/mL。研究结果为细菌B1213在白酒酿造中的应用提供理论基础。

越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性

利用氨基纳米黏土介导的转化方法,应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中,采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比,其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后,标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光,能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示,标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异,表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记,构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研究。

类鼻疽伯克霍尔德sRNA敲除株的构建及生物学功能初步评价

目的:构建类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei,B. pseudomallei)sRNA基因敲除菌株,并对其生物学功能进行初步评价。方法:设计合成引物9sF/9sR、9xF/9xR、R1/F1,扩增sRNA基因上下游同源臂片段,通过酶切、连接和转化,将目的片段克隆至质粒TPR-pK18mobSacB上,运用同源重组的方法获得类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA敲除菌株。结果:类鼻疽伯克霍尔德菌敲除株△sRNA构建成功。与野生株HNBP001比较,△sRNA生长速度、泳动能力、生物被膜形成能力均下降,药敏结果无差异。结论:成功构建类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA基因敲除株,为进一步研究sRNA在类鼻疽伯克霍尔德菌中的调控机制提供了基础。

海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌的药物敏感性分析

目的探讨海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌(BP)对常用抗生素的敏感性。方法以2008年1月—2013年3月在海南地区患者中分离的101株非重复类鼻疽伯克霍尔德菌作为研究对象,采用E-test法对目前国际上常用于治疗类鼻疽的抗生素进行药物敏感试验分析。结果本实验收集的101株类鼻疽菌中主要是以败血症为主,共有60人(59.4%),其次是肺部感染22人(21.8%),伤口及皮肤软组织感染有17人(16.8%),尿路感染2人(2.0%),受试者总死亡率为17.8%(18/101),其中72.2%(13/18)的死亡患者见于败血症患者。体外药敏试验结果显示,本次分离的所有类鼻疽对美罗培南、亚胺培南、左氧氟沙星、头孢他啶和阿莫西林/克拉维酸均显示良好的敏感性,敏感率分别为100%、100%、94.4%、92.1%和90.1%。对四环素和复方磺胺甲噁唑的敏感率分别为85.1%和84.2%。结论本研究和其他地区的报道都证实了类鼻疽伯克霍尔德菌对目前国际上常用于治疗该疾病的抗生素呈现良好的敏感性,其中以亚胺培南和美罗培南的敏感性最好,可作为治疗的首选。

湛江地区类鼻疽伯克霍尔德菌特征与流行病学研究

目的研究类鼻疽伯克霍尔德菌与常见其他伯克霍尔德菌间病原学特点及对药物敏感性的差异,为临床诊断、检验和治疗提供参考。方法对类鼻疽伯克霍尔德菌感染病例进行流行病学研究,并将其与常见医院感染皮氏伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌对常用抗菌药物的药敏结果进行比较分析。结果类鼻疽伯克霍尔德菌具有两端浓染,银白色菌落形态特征。在湛江,此菌感染以遂溪、廉江、吴川为主要疫区,好发于秋季,接触疫水、农民、免疫功能低下、年龄≥50岁为易感因素。其对复方磺胺甲口恶唑、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素、哌拉西林及其酶抑制复合制剂、头孢他啶、亚胺培南敏感率达100%,对氨基糖苷类、喹诺酮类和非抗假单胞菌属类药敏感性较差或耐药。结论类鼻疽伯克霍尔德菌感染属热带或亚热带地区传染病,水患易导致该菌流行;细菌具有染色、菌落形态特征,对药物的敏感性具有伯克菌属共同特征,易产生耐药,建议联合用药治疗。

抗类鼻疽伯克霍尔德菌多抗血清的制备及评价

目的制备抗类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudoamllei,其抗原简写为BP)多抗血清,评价不同处理方式对抗原免疫原性的影响。方法采用超声破碎、甲醛灭活、热灭活3种方式处理细菌抗原接种新西兰兔和BALB/C小鼠,检测不同抗原免疫动物抗血清的ELISA效价及凝集试验效价。结果 (1)ELISA方案最佳条件:二抗稀释度为1/8000,抗原包被浓度为4μg/mL或8μg/mL;凝集反应最佳条件:细菌浓度为6×109CFU/mL、凝集温度为37℃、观察时刻为4h。(2)超声破碎抗原(U-BP)免疫新西兰兔和小鼠的抗血清ELISA效价高达1/64000,最高血清凝集效价分别为1/32和1/64,甲醛灭活抗原(F-BP)抗血清ELISA效价高达1/16000,凝集效价为1/128和1/64;热灭活抗原(H-BP)抗血清ELISA效价达1/8000,凝集效价为1/16和1/64。(3)F-BP和H-BP具有较强的免疫原性,U-BP在小鼠中的免疫原性较弱(P<0.05)。结论建立了抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多克隆抗体的检测方法,制备了高效价的抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多抗血清;甲醛灭活和热灭活细菌具有较好的免疫原性,为下一步类鼻疽伯克霍尔德杆菌的致病机制研究和疫苗研发打下了基础。