糖尿病足合并类鼻疽伯克霍尔德菌感染64例临床特征、药敏特点和治疗分析

目的 总结糖尿病足(DF)合并类鼻疽伯克霍尔德菌(BP)感染的临床特征、药敏特点和治疗方法。方法 回顾分析2012年1月至2022年3月海南医学院第二附属医院收治的64例DF合并BP感染病人的临床表现、微生物抗菌药物敏感性及治疗手段。结果 64例DF合并BP感染病人中,60例有发热症状、34例有白细胞升高、均有C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)升高、14例合并肝或脾脓肿、30例出现肝功能不全、20例出现肾功能不全、18例合并感染性休克。64株BP对大多数常见的抗生素敏感性较差,但均对亚胺培南、美罗培南和复方磺胺甲唑敏感。所有病人均使用胰岛素积极控制血糖,大多数静脉应用碳青霉素烯类抗菌素约6周,出院后继续使用复方磺胺甲唑治疗。最终22例治愈,30例好转,8例未愈,4例死亡。死亡病例均合并多器官功能障碍。结论 DF合并BP主要表现为发热、CRP和PCT明显升高、合并肝或脾脓肿和肝肾功能不全,易出现感染性休克。对高度怀疑BP感染病人应多次进行培养,并及早静脉应用碳青霉素烯类抗菌素可能有助于改善预后。

海南省类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株的基因岛特征和毒力因子分析

目的分析类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)临床分离株的基因岛(genomic island,GI)特征和毒力因子差异,为类鼻疽病的诊疗研究提供依据。方法收集B.pseudomallei临床分离株,PCR检测和测序分析毒力相关GI,在Islandviewr 4平台上提交全基因组序列注释格式文件,整合SIGI-HMM与IslandPath-DIMOB两种算法预测GI,通过序列比对分析GI独特性和毒力因子差异。结果共收集到52株B.pseudomallei临床分离株,结果显示,52个基因组按进化距离分为3个分枝,其中82.69%(43/52)菌株集中在分枝1。52个B.pseudomallei基因组共识别出828个GI,按序列相似性聚类为157个GI cluster。GI在基因组中占比达2.05%~6.38%。GI cluster1和2存在全部菌株中,但84个(53.50%)GI cluster只聚类到单个基因组。10个GI cluster很可能是特有的,其中5个来源同属细菌,2个来源其他属,3个来源不确定。25个GI cluster与毒力相关,B.pseudomallei BP76和BP169含有其中8个,是所有菌株中毒力相关GI最多的。52株B.pseudomallei的毒力基因除了fhaB1、fhaB2、BPSL1661、cheY1、wzM、tssH-5/clpV、tssA-5、boaA和boaB存在差异,其余都表现一致。与泰国和澳大利亚B.pseudomallei临床菌株比较,boaA、boaB、cheY1和chbp在两个国家的菌株中都表现出差异,同时fhaB1、fhaB3和bimA在澳大利亚菌株中表现出差异。结论海南地区B.pseudomallei GI具有保守性和独特性,通过特有GI和毒力因子研究,可以发现菌株水平基因转移(Horizontal gene transfer,HGT)的来源和分子水平的毒力差异。

1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性和杀菌能力评估

为探究类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性,本试验采用双层平板法分离筛选类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体;采用形态学、一步生长曲线、宿主范围测定分析该噬菌体的生物学特性;通过小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测评估该噬菌体的疗效。结果显示,成功分离出1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体,命名为HNS1。形态学观察显示,噬菌体头部为正二十面体,直径为(62.8±3.0)nm,尾部长为(54.9±5.0)nm,根据命名法则该噬菌体属于肌尾噬菌体。一步生长曲线测定结果显示,该噬菌体的潜伏期约为32 min,释放量约为8.04 PFU/infection center。宿主范围测定结果显示,该噬菌体的裂解率达到73.3%(11/15)。小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测结果显示,该噬菌体能够有效在小鼠体内和环境中裂解类鼻疽伯克霍尔德菌。结果表明,筛选得到的噬菌体具有较广的裂解谱,可能成为治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的潜在抗菌剂。

类鼻疽伯克霍尔德菌致病及耐药机制

类鼻疽伯克霍尔德菌是导致类鼻疽的病原菌。类鼻疽慢性感染时间长,急性起病时临床表现不典型、易发生危及生命的并发症、预后不佳。研究病原菌类鼻疽伯克霍尔德菌的致病及耐药机制将有效帮助疾病的诊疗,改善预后。本文从类鼻疽伯克霍尔德菌在宿主细胞外运动的形式、感染宿主细胞的方式、毒力因子、耐药机制(外排泵、靶位点改变等)等方面阐述。为该菌所致类鼻疽的早期诊治及控制提供可能的方向。

类鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎1例并文献复习

类鼻疽病是一种需氧型革兰氏阴性杆菌类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病,具有多种临床表现,其中以类鼻疽伯克霍尔德菌性脓毒症最为严重。本文介绍了广东医科大学附属东莞第一医院1例以反复发热、咳嗽、咳痰为主要临床表现的患者,该患者上述症状反复,常规抗生素治疗无效,通过超声引导下肺门淋巴结穿刺术等检查考虑类鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎,予维护器官功能、亚胺培南等抗感染为主要治疗手段。患者无主诉不适出院,后期随访无再次发热等症状。结合治疗中的问题,本文回顾复习相关文献,对假鼻疽伯克霍尔德菌肺炎伴脓毒症、坏死性淋巴结炎患者诊治经验进行报道。类鼻疽病临床诊断非常具有挑战性,容易误诊或漏诊。临床上碰到诊断不明确的相关感染性疾病,要及时考虑到类鼻疽伯克霍尔德菌感染可能,明确临床工作者对类鼻疽病早期诊断和治疗的重要性,避免误诊、漏诊。

海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌的药物敏感性分析

目的探讨海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌(BP)对常用抗生素的敏感性。方法以2008年1月—2013年3月在海南地区患者中分离的101株非重复类鼻疽伯克霍尔德菌作为研究对象,采用E-test法对目前国际上常用于治疗类鼻疽的抗生素进行药物敏感试验分析。结果本实验收集的101株类鼻疽菌中主要是以败血症为主,共有60人(59.4%),其次是肺部感染22人(21.8%),伤口及皮肤软组织感染有17人(16.8%),尿路感染2人(2.0%),受试者总死亡率为17.8%(18/101),其中72.2%(13/18)的死亡患者见于败血症患者。体外药敏试验结果显示,本次分离的所有类鼻疽对美罗培南、亚胺培南、左氧氟沙星、头孢他啶和阿莫西林/克拉维酸均显示良好的敏感性,敏感率分别为100%、100%、94.4%、92.1%和90.1%。对四环素和复方磺胺甲噁唑的敏感率分别为85.1%和84.2%。结论本研究和其他地区的报道都证实了类鼻疽伯克霍尔德菌对目前国际上常用于治疗该疾病的抗生素呈现良好的敏感性,其中以亚胺培南和美罗培南的敏感性最好,可作为治疗的首选。

特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化

目的以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法并优化。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件。得到最优PCR反应条件后,将该方法用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法的有效性和特异性。结果共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性40 s,54.5℃退火20 s,72℃延伸40 s,24个循环,最后延伸1 min;特异性分析发现此方法能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断。结论成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌。

湛江地区类鼻疽伯克霍尔德菌特征与流行病学研究

目的研究类鼻疽伯克霍尔德菌与常见其他伯克霍尔德菌间病原学特点及对药物敏感性的差异,为临床诊断、检验和治疗提供参考。方法对类鼻疽伯克霍尔德菌感染病例进行流行病学研究,并将其与常见医院感染皮氏伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌对常用抗菌药物的药敏结果进行比较分析。结果类鼻疽伯克霍尔德菌具有两端浓染,银白色菌落形态特征。在湛江,此菌感染以遂溪、廉江、吴川为主要疫区,好发于秋季,接触疫水、农民、免疫功能低下、年龄≥50岁为易感因素。其对复方磺胺甲口恶唑、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素、哌拉西林及其酶抑制复合制剂、头孢他啶、亚胺培南敏感率达100%,对氨基糖苷类、喹诺酮类和非抗假单胞菌属类药敏感性较差或耐药。结论类鼻疽伯克霍尔德菌感染属热带或亚热带地区传染病,水患易导致该菌流行;细菌具有染色、菌落形态特征,对药物的敏感性具有伯克菌属共同特征,易产生耐药,建议联合用药治疗。

抗类鼻疽伯克霍尔德菌多抗血清的制备及评价

目的制备抗类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudoamllei,其抗原简写为BP)多抗血清,评价不同处理方式对抗原免疫原性的影响。方法采用超声破碎、甲醛灭活、热灭活3种方式处理细菌抗原接种新西兰兔和BALB/C小鼠,检测不同抗原免疫动物抗血清的ELISA效价及凝集试验效价。结果 (1)ELISA方案最佳条件:二抗稀释度为1/8000,抗原包被浓度为4μg/mL或8μg/mL;凝集反应最佳条件:细菌浓度为6×109CFU/mL、凝集温度为37℃、观察时刻为4h。(2)超声破碎抗原(U-BP)免疫新西兰兔和小鼠的抗血清ELISA效价高达1/64000,最高血清凝集效价分别为1/32和1/64,甲醛灭活抗原(F-BP)抗血清ELISA效价高达1/16000,凝集效价为1/128和1/64;热灭活抗原(H-BP)抗血清ELISA效价达1/8000,凝集效价为1/16和1/64。(3)F-BP和H-BP具有较强的免疫原性,U-BP在小鼠中的免疫原性较弱(P<0.05)。结论建立了抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多克隆抗体的检测方法,制备了高效价的抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多抗血清;甲醛灭活和热灭活细菌具有较好的免疫原性,为下一步类鼻疽伯克霍尔德杆菌的致病机制研究和疫苗研发打下了基础。

一种快速定量检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法建立及评价

目的采用实时荧光定量PCR技术,建立并评价一种快速、准确、特异检测类鼻疽伯克霍尔德菌的定量检测方法。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅲ型分泌系统保守基因序列设计引物和探针,构建重组质粒作为DNA标准品,优化荧光定量PCR体系,同时进行方法学评价,并与以16S rRNA基因为靶序列的荧光定量PCR方法进行对比。结果建立了检测类鼻疽伯克霍尔德菌的荧光定量PCR方法,其线性范围为1×101~1×1010拷贝/μL;其灵敏度为10拷贝/μL;批内变异系数（CV）为1.43%~4.6%;对用24份模拟血液标本和67份稻田土壤标本分别采用本法和对照方法进行检测,本菌配制的模拟标本采用两种方法检测均为阳性,且能准确定量,阳性率为100%,而含有其他常见感染细菌的标本检测结果均为阴性;土壤标本中有12份标本采用本法和与细菌培养法均为阳性,但是对照方法未能检测出其中两份低浓度的土壤标本。结论建立的类鼻疽伯克霍尔德菌定量PCR方法具有快速、准确、灵敏度高等特点,可作为环境中该菌检测和疫区类鼻疽病诊断的有效工具。

糖尿病合并类鼻疽伯克霍尔德菌败血症临床研究

目的分析糖尿病合并类鼻疽伯克霍尔德菌败血症的临床特点,并探讨其诊疗策略和措施。方法回顾性分析21例糖尿病合并类鼻疽伯克霍尔德菌败血症的临床特点、诊疗经过和转归。结果类鼻疽伯克霍尔德菌败血症临床表现多样化,缺乏特异性,常表现为急性暴发性败血症和常伴组织器官脓肿形成及易诱发糖尿病酮症酸中毒(DKA),病情凶险,误诊率和死亡率高且可选用的有效抗生素较少,易复发,治疗周期长。结论早期诊断,尽早足量应用敏感抗生素,有脓肿者宜配合外科治疗,以及使用胰岛素积极控制好血糖和加强支持疗法是治疗成功的关键。

类鼻疽菌素是类鼻疽伯克霍尔德菌的主要毒力因子之一

目的研究类鼻疽菌素在类鼻疽伯克霍尔德菌(Bulkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)致病性中的作用。方法通过基因同源重组的方法突变类鼻疽菌素的主要合成酶基因mes C,检测野生菌和突变菌产生类鼻疽菌素能力的差异以及突变前后该菌对微生物(2株真菌:青霉菌、黑曲霉菌;2株细菌:粪链球菌、金黄色葡萄球菌)、线虫、小鼠的毒力差异。结果突变菌的菌落形态发生了明显变化,失去了产生菌膜的能力,同时也失去了对微生物的抑制活性和对线虫、小鼠的致病性。结论类鼻疽菌素可能是B.pseudomallei的主要毒力因子之一,在其致病性中起着重要的作用。

海南1例感染类鼻疽伯克霍尔德菌的溯源调查

目的对海南1例类鼻疽患者进行感染溯源调查,为类鼻疽防控提供科学依据。方法采集患者住所周边环境中的泥土、水等样品并进行类鼻疽病原菌分离。通过细菌学试验、16SrDNA测序、特异诊断PCR等方法对疑似菌株进一步鉴定。通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点可变数串联重复序列分析(MLVA_4)等技术比较并确定环境分离菌株与临床菌株的同源性。结果采集的58份环境样品中,自患者及邻居家水井水中共分离出3株类鼻疽伯克霍尔德菌(简称类鼻疽伯克菌)。PFGE、MLST、MLVA等分子分型结果证实,1株自患者家井水中分离的类鼻疽伯克菌与患者临床分离株同源。结论患者及其邻居家水井均被类鼻疽伯克菌污染,水井水很可能是该患者感染类鼻疽病的感染源。

类鼻疽伯克霍尔德菌败血症25例临床分析

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌败血症临床特点,总结诊断和治疗经验,提高诊疗水平。方法回顾性分析25例类鼻疽伯克霍尔德菌败血症的临床表现、诊疗经过和转归。结果类鼻疽伯克霍尔德菌败血症临床表现多样化,多合并有糖尿病,误诊率高,病情凶险,且可选用的有效抗生素较少,疗程长。结论加强认识,早期诊断,尽早使用敏感抗生素,是治疗成功的关键。

104例类鼻疽伯克霍尔德菌感染与耐药性分析

目的分析类鼻疽伯克霍尔德菌感染的临床特征,探讨其耐药性及治疗。方法回顾性分析本院2000年1月至2009年1月住院的104例类鼻疽伯克霍尔德菌感染者的临床表现、细菌的耐药性及其治疗。结果患者多见于男性,以农民发病最多,临床表现均有畏寒或寒战、发热。类鼻疽伯克霍尔德菌对抗菌药物具有多重耐药性,对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、头孢唑啉耐药率为100%,阿米卡星95.2%,氨苄西林/舒巴坦79.8%,环丙沙星77.8%,左氧氟沙星70.2%,复方新诺明64.4%,头孢曲松70.2%,头孢他定24%,哌拉西林/他唑巴坦18.3%,未发现对亚胺培南耐药。结论类鼻疽伯克霍尔德菌感染临床表现无特殊性,误诊率高,确诊依靠细菌学检测。亚胺培南对类鼻疽伯克霍尔德菌敏感,应作为治疗类鼻疽首选用药。

羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列(登录号:NC_006351.1)设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425bp的特异性条带,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到约为5 000和1 500bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10mmol/L,诱导时间8h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0^+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。

3种方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定

目的用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果。方法分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔德菌和5株类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,综合判断鉴定结果,并与传统的形态学和生化鉴定结果比较,寻找更适合于该两种菌的鉴定方法。结果在10株受试菌株中,2株排除是鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的可能,剩余8株之中,MALDI-TOF-MS方法正确鉴定了6株,双重荧光定量PCR方法正确鉴定了8株,16S rRNA基因序列分析方法正确鉴定4株。结论 MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法和双重荧光定量PCR方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌具有很好的鉴定能力,16S rRNA基因序列分析方法不适合用于该2种菌的鉴定。

类鼻疽伯克霍尔德菌致血流感染1例

类鼻疽病（melioidosis）是由类鼻疽伯克霍尔德菌所导致的地方性传染病,主要流行于澳大利亚中部、东南亚等热带和亚热带地区。该菌常存在于疫区水、土壤、粪便及尸体中,可经破损皮肤接触含有致病菌的水或土壤而感染,也可经呼吸道感染[1]。2014年10月,本组从1例高烧患者血液标本中分离出类鼻疽伯克霍尔德菌,报道如下。1资料与方法1.1一般资料患者,男,39岁,因发热、右下肢肿痛入院。

类鼻疽伯克霍尔德菌BPSL1549基因敲除株的构建及鉴定

目的构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株[BP(△BPSL1549)],建立有效的类鼻疽菌毒力基因敲除平台。方法设计引物扩增类鼻疽菌BPSL1549基因上下游同源臂,连接至p K18mob Sac B自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1λpir以接合方式将其转入类鼻疽菌中。利用同源重组原理替换野生株中的BPSL1549基因,经过蔗糖筛选靶标基因敲除株,并采用PCR、Western blot检测方法鉴定敲除株,利用动物模型评价敲除株表型变化。结果 BP(△BPSL1549)菌株与野生株的BPSL1549基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少600 bp,Western blot检测敲除株不表达BPSL1549基因编码蛋白,成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株。动物实验证实敲除株相比野生株毒力显著降低(P<0.05)。结论利用同源重组原理成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株,完善了类鼻疽菌敲除平台和评价体系。