类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。

海南省类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株的基因岛特征和毒力因子分析

目的分析类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)临床分离株的基因岛(genomic island,GI)特征和毒力因子差异,为类鼻疽病的诊疗研究提供依据。方法收集B.pseudomallei临床分离株,PCR检测和测序分析毒力相关GI,在Islandviewr 4平台上提交全基因组序列注释格式文件,整合SIGI-HMM与IslandPath-DIMOB两种算法预测GI,通过序列比对分析GI独特性和毒力因子差异。结果共收集到52株B.pseudomallei临床分离株,结果显示,52个基因组按进化距离分为3个分枝,其中82.69%(43/52)菌株集中在分枝1。52个B.pseudomallei基因组共识别出828个GI,按序列相似性聚类为157个GI cluster。GI在基因组中占比达2.05%~6.38%。GI cluster1和2存在全部菌株中,但84个(53.50%)GI cluster只聚类到单个基因组。10个GI cluster很可能是特有的,其中5个来源同属细菌,2个来源其他属,3个来源不确定。25个GI cluster与毒力相关,B.pseudomallei BP76和BP169含有其中8个,是所有菌株中毒力相关GI最多的。52株B.pseudomallei的毒力基因除了fhaB1、fhaB2、BPSL1661、cheY1、wzM、tssH-5/clpV、tssA-5、boaA和boaB存在差异,其余都表现一致。与泰国和澳大利亚B.pseudomallei临床菌株比较,boaA、boaB、cheY1和chbp在两个国家的菌株中都表现出差异,同时fhaB1、fhaB3和bimA在澳大利亚菌株中表现出差异。结论海南地区B.pseudomallei GI具有保守性和独特性,通过特有GI和毒力因子研究,可以发现菌株水平基因转移(Horizontal gene transfer,HGT)的来源和分子水平的毒力差异。

类鼻疽伯克霍尔德菌致病及耐药机制

类鼻疽伯克霍尔德菌是导致类鼻疽的病原菌。类鼻疽慢性感染时间长,急性起病时临床表现不典型、易发生危及生命的并发症、预后不佳。研究病原菌类鼻疽伯克霍尔德菌的致病及耐药机制将有效帮助疾病的诊疗,改善预后。本文从类鼻疽伯克霍尔德菌在宿主细胞外运动的形式、感染宿主细胞的方式、毒力因子、耐药机制(外排泵、靶位点改变等)等方面阐述。为该菌所致类鼻疽的早期诊治及控制提供可能的方向。

类鼻疽菌素是类鼻疽伯克霍尔德菌的主要毒力因子之一

目的研究类鼻疽菌素在类鼻疽伯克霍尔德菌(Bulkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)致病性中的作用。方法通过基因同源重组的方法突变类鼻疽菌素的主要合成酶基因mes C,检测野生菌和突变菌产生类鼻疽菌素能力的差异以及突变前后该菌对微生物(2株真菌:青霉菌、黑曲霉菌;2株细菌:粪链球菌、金黄色葡萄球菌)、线虫、小鼠的毒力差异。结果突变菌的菌落形态发生了明显变化,失去了产生菌膜的能力,同时也失去了对微生物的抑制活性和对线虫、小鼠的致病性。结论类鼻疽菌素可能是B.pseudomallei的主要毒力因子之一,在其致病性中起着重要的作用。

类鼻疽伯克霍尔德致死因子

类鼻疽伯克霍尔德菌是一种胞内感染的革兰阴性杆菌,所导致的疾病称为类鼻疽。迄今为止,还没有针对类鼻疽的疫苗。其致死因子1(BLF1)作为类鼻疽伯克霍尔德菌的重要致病因子,能抑制宿主细胞翻译起始因子e IF4A的解旋酶活性,从而抑制蛋白质合成。BLF1作为e IF4A的抑制剂,有望成为靶向抗肿瘤药物。同时,BLF1具有很强的免疫原性,对其进行结构改造后,可成为类鼻疽疫苗的候选抗原。

类鼻疽伯克霍尔德菌致病机制的分子与细胞基础

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)是引起主要发生在东南亚和澳大利亚北部的一种人兽共患病类鼻疽的潜在病原。明确该疾病致病机理及其宿主与病原的互作将加强对该条件致病菌的发病机制的理解。本研究从影响细菌致病性的毒力因子和病原与宿主互作两个方面阐述类鼻疽伯克霍德尔菌的致病机理,为该菌的有效控制提供可能的机制。

类鼻疽伯克霍尔德菌感染与免疫逃逸机制的研究进展

类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)(简称类鼻疽菌)感染引起的一种热带医学疾病。该病临床表现复杂多样,严重感染时可快速发展为败血症,病死率高达40%。越来越多的证据表明,它是一种正在扩散的人兽共患传染病。本文就近年来关于类鼻疽菌感染的重要毒力因子以及其在免疫逃逸中的作用机制研究进展进行总结,以期了解类鼻疽菌的致病机制,为将来有效疫苗和治疗药物的研发提供理论指导。

类鼻疽伯克霍尔德菌AraC转录因子基因的原核表达及纯化

目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子基因设计特异性扩增引物,将PET-28a(+)质粒和扩增得到的AraC转录因子基因产物同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),采用最佳浓度IPTG进行诱导,采用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。通过Ni^(2+)柱纯化目的蛋白,采用Western blot检测纯化蛋白的免疫反应性。结果特异性引物扩增得到的产物大小约为1000 bp,与目的基因片段1032 bp基本一致。将扩增产物与PET-28a(+)载体连接后测序,与预期完全一致。重组载体转化BL21(DE3)后用最适IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导过夜(约16 h),SDS-PAGE检测表达产物分子质量在40~55 ku之间,与预期相符。表达蛋白纯化后进行Western blot,能被相应抗体识别。结论成功克隆得到AraC转录因子基因,,构建的含AraC转录因子基因原核表达载体转化DE3后经IPTG诱导可表达出融合蛋白,经Ni^(2+)柱纯化得到具有免疫反应原性的AraC转录因子蛋白,为AraC转录因子的功能研究奠定了基础。

通过细胞穿膜肽和皂苷增强一种核糖体失活蛋白抗肿瘤活性

将核糖体失活蛋白类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1(BLF1)与细胞穿膜肽(CPP)HBP融合表达并与商陆皂苷甲(EsA)联合使用,提高BLF1重组蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性。通过原核表达及NI-NTA亲和层析纯化BLF1、BLF1-HBP融合蛋白,以HepG2、MCF-7、A549和HeLa细胞为检测模型,MTT法检测BLF1重组蛋白对肿瘤细胞的毒性,激光共聚焦显微镜观察重组蛋白进入细胞效率,流式细胞术分析抗肿瘤效应。结果显示,穿膜肽HBP可有效提高BLF1对HepG2、MCF-7、A549和HeLa四种肿瘤细胞的生长抑制作用,其中对HeLa细胞的药效增强效果最显著,可达47.5倍;皂苷EsA的使用进一步显著提高了BLF1-HBP对上述4种肿瘤细胞生长抑制活性,且对MCF-7细胞的IC50值从6840nmol/L降至0.57nmol/L。激光共聚焦观察揭示EsA可有效促进BLF1重组蛋白进入肿瘤细胞效率,流式结果分析表明EsA可大大强化BLF1-HBP诱导肿瘤细胞凋亡的能力。将BLF1与穿膜肽HBP融合表达并在EsA存在下,可显著提升BLF1对肿瘤细胞的毒性,强化其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。